轉錄組分析sgf73基因缺失對粟酒裂殖酵母生長代謝影響的分子機制

劉欣嵐 葉姿妤 魯艷 侯怡鈴 周麗倩 蒲帝宏 丁祥

摘要： 為研究粟酒裂殖酵母sgf73基因缺失后的關鍵基因和關鍵代謝通路，采用RNA-Seq測序技術對野生型酵母菌株及sgf73基因缺陷型菌株進行測序及生物信息學分析，并進行GO和KEGG功能富集分析.? 結果表明： sgf73基因缺陷型菌株中高表達基因有1 834個，極高表達基因有6個，且有1 714個差異表達基因，包括934個上調基因，780個下調基因;?? sgf73基因敲除導致細胞代謝和跨膜轉運過程異常變化;?? MAPK信號通路中參與周期調控cki1，cki2和cdc25基因的下調導致sgf73Δ菌株有絲分裂時間延長； 調控細胞骨架rgf2，rho1和stt4基因的下調導致sgf73Δ菌株肌動蛋白環收縮異常.

關鍵詞： 粟酒裂殖酵母； RNA-Seq測序； sgf73基因； 差異表達基因；? MAPK信號通路

中圖分類號： Q343? 文獻標志碼： A? 文章編號： 1671-5489（2023）02-0426-11

Molecular Mechanism of Eeffect of sgf73 Gene Deletion on? Growth and Metabolism of Schizosaccharomyces pombe by Transcriptome Analysis

LIU Xinlan1，YE Ziyu2， LU Yan2，HOU Yiling2，ZHOU Liqian2，PU Dihong2，DING Xiang1

（1. College of Environmental Science and Engineering， China West Normal University， Nanchong 637009，Sichuan Province，China;? 2. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation of the Ministry? of Education，College of Life Science， China West Normal University， Nanchong 637009，Sichuan Province，China）

收稿日期： 2022-06-11.

第一作者簡介：? 劉欣嵐（1998—），女，漢族， 碩士研究生，從事環境微生物學的研究， E-mail： 3263407070@qq.com.

通信作者簡介：? 丁 祥（1980—），男，漢族， 博士，教授，從事環境微生物學的研究，E-mail：? biostart8083@126.com.

基金項目： 四川省科技廳應用基礎重點項目（批準號： 2018JY0087）、 四川省科技廳重點研發項目（批準號： 2018NZ0055）和南充市科技局發展計劃項目（批準號：? 20YFZJ0053；? 20YFZJ0054）.

Abstract：??? In order to study the key genes and key metabolic pathways after the sgf73 gene was knocked out in Schizosaccharomyces pombe， the wild-type yeast strains and sgf73Δ? gene-deficient strains were sequenced and bioinformatics analyzed by RNA-Seq sequencing technology，and the GO and KEGG functional enrichment analysis were carried out.? The results show that in the sgf73Δ gene-deficient strains， there are 1 834 highly expressed genes， including 6 extremely highly expressed genes， and 1 714 differentially expressed genes， of which 934 genes are up-regulated and 780 genes are down-regulated. The? sgf73 gene knockout leads to? abnormal changes in cellular metabolism and transmembrane transport. The? down-regulation of cki1，cki2 and cdc25 genes involved in cycle regulation in the MAPK signaling pathway leads to prolongation of mitotic time in sgf73Δ strain， the down-regulation of regulatory cytoskeleton rgf2，rho1 and stt4 genes leads to abnormal contraction? of actin ring of? sgf73Δ strain.

Keywords： Schizosaccharomyces pombe;? RNA-Seq sequencing;? sgf73 gene;? differentially expressed genes （DEGs）;? MAPK signaling pathway

粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）具有典型的真核細胞周期，是研究真核細胞生長、 發育和凋亡的重要模式生物［1］，其在釀酒工藝生產中應用廣泛. 菌株分裂是一個高度保守調控過程，需有序協調一系列在時間和空間上調控的事件，包括在分裂部位形成肌動蛋白環、 環收縮、 膜溝形成和細胞外基質重塑，該過程對維持菌株的基因組完整性至關重要. 菌株分裂功能障礙或失調會導致菌株的生長和代謝功能缺陷，喪失對菌株發酵過程有效調節和控制［2-3］.

sgf73基因是基因編碼SAGA（Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase）復合物中的SGF73蛋白亞基（SAGA complex subunit SGF73），由344個氨基酸組成，相對分子質量為38 580（38.58 kDa），與SUS1，SGF11 和UBP8（酶學活性亞基）共同組成SAGA 復合物的去泛素化模塊（deubiquitination module， DUBm）［4］，在染色質修飾、 轉錄、 DNA 損傷修復和mRNA 轉運等過程中發揮作用［5］. SGF73 作為一個 SAGA 復合物亞基，負責在 SAGA 主體結構上錨定去泛素化模塊，與 SAGA 復合物一起發揮作用，同時SGF73作為組蛋白H2B泛素水平的調節因子，參與轉錄起始和修飾. 在菌株分裂中，SGF73蛋白通過觸發菌株周期蛋白依賴性激酶（CDK）底物的去磷酸化，從而調節G2/M期的過渡. sgf73 基因缺失會直接引起去泛素化模塊解離［6］，導致組蛋白 H2B 泛素化水平整體上調［7］，引發RNA誘導的轉錄沉默復合物（RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing，RITS）裝配異常［8］，顯著降低菌株生長速率并導致菌株形態異常［9］. sgf73基因異常還可導致胞質分裂缺陷［10］，同時導致菌株發酵的正向調控機制失常.

對sgf73基因缺失后菌株有絲分裂中紡錘體、 染色體和肌動蛋白的細胞動力學研究表明，sgf73基因敲除導致子囊孢子數目減少，其中產4個子囊孢子的sgf73Δ比野生型菌株減少了（4.07±1.72）%，紡錘體形成缺陷，單極紡錘體增加，同時肌動蛋白形成的分裂環在有絲分裂中從形成到消失的時間縮短了（7.65±3.55）min，速率降低了（0.02±0.01）μm/min，并導致染色體分離缺陷. 但sgf73基因缺失后導致有絲分裂中紡錘體組裝、 染色體分離及肌動蛋白分裂環收縮缺陷的關鍵基因和信號通路尚未見文獻報道. 基于此，本文采用RNA-Seq測序技術對野生型和基因敲除型sgf73Δ菌株測序并進行生物信息學分析，揭示sgf73基因缺失后菌株異常生長過程中的關鍵基因和關鍵代謝通路，為提高粟酒裂殖酵母菌發酵產率及代謝規律研究提供一定科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粟酒裂殖酵母菌株（S.pombe）保存于西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，其中PT286菌株的基因型為h-wt，1003菌株的基因型為h+sgf73Δ：? KanR.

酵母提取物、 葡萄糖和瓊脂購于美國Thermo Fisher Scientific公司； 組氨酸（L-Histidine）、 亮氨酸（L-Leucine）、 賴氨酸（L-Lysine）、 腺嘌呤和尿嘧啶購于美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司.

全自動壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30FA型，上海申安醫療器械廠）； 超清工作臺（SE-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術有限公司）； 恒溫搖床（THZ-Q型，上海百典儀器設備有限公司）；? 酶標儀（Epoch型，美國基因有限公司）； 電熱恒溫培養箱（DPX-9272B-1型，美國賽默飛世爾科技公司）； 電子分析天平（AR2130型，美國奧豪斯儀器有限公司）； -80 ℃超低溫冰箱（BCD-208K/A型，青島海爾股份有限公司）； 移液槍（Eppendorf型，德國艾本德國際貿易有限公司）；? 離心機（5418R型，德國艾本德國際貿易有限公司）.

1.2 方 法

1.2.1 菌種復蘇及活化

將用體積分數30%的無菌甘油凍存于-80 ℃超低溫冰箱中編號為PT286和1003的菌種取出，在YE5S固體培養基上均勻涂布，置于25 ℃恒溫培養箱中，恒溫培養約48 h. 從YE5S固體培養基上刮取適量PT286和1003菌體，接種至5 mL YE5S培養液中，于25 ℃，120 r/min恒溫搖床培養24 h； 用酶標儀測得OD595為0.5～0.8后［11］，取1 mL菌液離心，收集離心后的菌體保存于1 mL的Trizol溶液中，并標記樣品名稱.

1.2.2 樣品質量檢測

將保存于Trizol中的裂殖酵母細胞冷凍，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行樣品RNA提取及質量檢測： 采用瓊脂糖凝膠電泳技術，分析RNA的降解程度以及污染狀況； 采用NanoDrop檢測RNA的純度（OD260/OD280）； 采用Qubit技術對RNA的濃度進行精確定量； 采用Agilent2100方法精確檢測RNA的完整性. 樣品檢測合格后，構建cDNA文庫，庫檢合格后上機測序.

1.2.3 生物信息學分析

整理野生型（wt）和基因敲除型（sgf73Δ）菌株的總RNA測序獲得原始數據（raw reads），去除接頭數據和低質量數據，得到分析數據（clean reads），用Hisat2軟件將分析數據與參考基因組進行快速精確比對，用Feature Counts，Stringtie和Subread軟件對基因表達進行定量分析，用DESeq2和EdgeR軟件對樣本的基因表達量進行差異顯著性分析，用Cluster Profile軟件對差異基因進行GO和KEGG功能富集分析.

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據質量分析

將酵母細胞轉錄組RNA-Seq測序得到的原始數據過濾后，野生型菌株分別獲得6.97，6.78，6.66 Gb分析數據，sgf73Δ菌株分別獲得6.68，6.63，6.72 Gb分析數據，結果列于表1. 由表1可見：? 野生型菌株和sgf73Δ菌株3次測序結果平均值的堿基錯誤率均低于0.03%； Q30值分別大于94.11%和93.84%； GC堿基無AT和GC分離現象，其含量分別為41.36%和41.74%，符合酵母基因組GC含量分布特征.

2.2 基因表達水平分析

通過RSEM軟件信息學分析后，對野生型和sgf73Δ菌株的基因表達量進行定量分析和比較，設定基因高水平表達為FPKM>60，基因低水平表達或不表達為FPKM<0.3［12］. 野生型菌株有5 239個基因表達，約占基因總數的71.73%，其中有1 967個基因高表達，約占基因總數的26.93%； sgf73Δ菌株有5 369個基因表達，約占基因總數的73.51%，其中有1 834個基因高表達，約占基因總數的25.11%.

進一步分析發現，野生型菌株有9個基因為極高表達（FPKM>4 000），分別為gpd3，zym1，hsp9，hsp16，fba1，eno101，tdh1，pgk1，tef103. sgf73Δ菌株有6個基因為極高表達，分別為tdh1，hsp9，fba1，eno101，tpi1，tef103. 結果列于表2 .

由表2可見，gpd3，pgk1，hsp16基因僅在野生型菌株中極高表達，tpi1基因僅在sgf73Δ組中極高表達， hsp9在sgf73Δ菌株中的FPKM值從7 879.47下降為6 414.72. gpd3，pgk1和tpi1基因共同編碼糖酵解途徑的關鍵酶［13-14］，而糖酵解酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶與有絲分裂突變抑制因子Mcs4 （mitotic catastrophe suppressor）可通過物理相互作用激活 MAP 激酶級聯反應協調細胞有絲分裂過程. 熱休克蛋白Hsp9和Hsp16參與細胞核內細胞周期G2-M檢查點的調節，并調控細胞末期細胞板的形成和F-肌動蛋白收縮環結構穩定性［15］. 肌動蛋白作為真核細胞的細胞骨架中重要組成部分，在有絲分裂時形成分裂環，維持一段時間后進入收縮期，有絲分裂結束后將細胞一分為二，且多種關鍵基因功能缺失可導致細胞分裂過程中肌動蛋白分裂環形成和細胞有絲分裂時間延長，如在裂殖酵母細胞中，ain1（編碼α-肌動蛋白）影響細胞分裂過程和肌動蛋白細胞骨架組成，該基因缺失后導致收縮環變形、 收縮異常［16］.? 野生型菌株和sgf73Δ菌株形成分裂環維持時間分別為（12.90±2.66）min和（16.8±2.88）min，相比野生型菌株延長了（3.90±0.22）min. 野生型菌株和sgf73Δ菌株有絲分裂中紡錘體從形成到斷裂的總時間分別為（30.15±2.48）min和（38.78±8.03）min，相比野生型菌株延長了（8.63±5.55）min.? 可見，sgf73基因敲除導致分裂環在有絲分裂中維持時間極顯著延長后，有絲分裂總時間極顯著延長（P<0.01）. 該結果與本文中gpd3，pgk1，hsp16，tpi1等高表達基因定量分析結果顯示敲除sgf73基因后細胞分裂中收縮環的動力學及正常生長代謝過程發生改變，導致細胞有絲分裂過程異常相符.

2.3 差異表達基因（DEGs）分析

使用DESeq軟件對野生型和sgf73Δ菌株的轉錄組數據進行差異表達基因（DEGs）分析，設置顯著差異表達閾值為校正后的P值（padj）<0.05、 差異倍數（|log2FoldChange|）>0，結果分別如圖1和圖2所示. 兩組間差異表達基因有1 714個，其中934個基因上調，780個基因下調. 上調差異倍數較大的10個基因為mat2-Pc，mat2-Pi，tf2-13，grt1，str3，isp3，aat1，prl51，tlh2，mug146，下調差異倍數較大的10個基因為mat3-Mc，mat1-Mc，dak2，mat3-Mc，rik1，agl1，5S_rRNA，cao2，gal7，eno102，分別列于表3和表4.

由表3和表4可見，差異最顯著的基因包括上調的tf2-13，grt1，isp3和下調的mat3-Mc，mat1-Mc基因. 其中，tf2-13基因在營養缺陷的脅迫環境下上調表達［17］； grt1基因可應對環境和生理壓力并調控相關基因表達［18］； isp3基因定位于細胞孢子壁上，對抵抗環境壓力的脅迫起主要作用，可提高對熱環境、 消化酶和乙醇的耐受性［19］.? mat3-Mc和mat1-Mc基因以序列特異性方式與 DNA 結合，調控細胞交配型區域，同時調控粟酒裂殖酵母的減數分裂［20］. 在sgf73Δ菌株中，tf2-13，grt1和isp3基因分別上調8.458 7，5.5183，4.773 4倍，表明sgf73基因與上述基因共同作用通過內部調節以適應脅迫環境下的存活. 在細胞減數分裂過程中，多種關鍵基因突變會導致細胞分裂異常且影響產孢數量，如nce102（編碼173個氨基酸的跨膜蛋白），該基因缺失可導致孢子分生異常［21］； 在裂殖酵母中，裂變酵母突觸蛋白直向同源物syb1與高爾基體后分泌囊泡相關，在氮饑餓條件下形成異常孢子壁，并影響孢子形成［22］.? sgf73基因缺失導致子囊孢子數目顯著減少，野生型菌株99.2 %產生4個子囊孢子，sgf73Δ菌株（95.13±1.72）%產生4個子囊孢子，與野生型菌株相比減少了（4.07±1.72）%，具有顯著差異（P<0.05），表明sgf73基因可能與裂殖酵母有性生殖相關. sgf73基因敲除后，mat3-Mc和mat1-Mc基因分別下調6.985 3，5.465 9倍，表明sgf73Δ菌株中細胞減數分裂調控過程被抑制，從而減數分裂發生異常，子囊孢子減少.

2.4 差異基因GO 富集分析

對野生型和sgf73Δ菌株的差異基因進行GO富集分析，包括對生物過程（BP）、 細胞組分（CC）和分子功能（MF）進行分析比較，并選取上調和下調的差異表達基因GO富集最顯著的30個類別繪制柱狀圖和散點圖，

結果分別如圖3～圖6所示. 由圖3～圖6可見，與野生型相比，sgf73Δ菌株中的差異表達基因富集到201個GO類別，包括122個生物過程、 47個細胞組分和32個分子功能. 其中，在生物過程中，代謝和能量合成過程被顯著富集，特別是磷酸化過程以及前體代謝物和能量的產生過程，分別有82，40個下調基因被富集； 在細胞組分中，胞質核糖體部分有63個上調基因被顯著富集； 在分子功能中，有關跨膜轉運蛋白活性和轉運活動的71個下調基因被顯著富集.

a. 減數分裂細胞周期調節; b. 跨膜運輸; c. 陰離子跨膜轉運; d. 離子跨膜轉運; e. 減數分裂細胞周期正向調節; f. 谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程; g. 谷氨酰胺家族氨基酸分解代謝過程; h. 多生物過程調節; i. 離子傳輸; j. 細胞金屬離子穩態; k. 細胞外區域; l. 胞質核糖體; m. 等離子體膜; n. 質膜組成部分; o. 胞質部分; p. 細胞壁; q. 外部封裝結構; r. 細胞質大核糖體亞單位; s. 細胞質小核糖體亞單位; t. 質膜固有成分; u. 跨膜轉運蛋白活性; v. 運輸活動; w. 無機分子實體跨膜轉運活性; x. 離子跨膜轉運蛋白活性;? y. 核糖體結構組成; z. 磷酸酶活性; α. 陰離子跨膜轉運蛋白活性; β. 離子反轉運體活性; γ. 二級活性跨膜轉運蛋白活性; δ. 有機陰離子跨膜轉運蛋白活性.

a. 減數分裂細胞周期調節; b. 跨膜運輸; c. 陰離子跨膜轉運; d. 離子跨膜轉運; e. 減數分裂細胞周期正向調節; f. 谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程; g. 谷氨酰胺家族氨基酸分解代謝過程; h. 多生物過程調節; i. 離子傳輸; j. 細胞金屬離子穩態; k. 細胞外區域; l. 胞質核糖體; m. 等離子體膜; n. 質膜組成部分; o. 胞質部分; p. 細胞壁; q. 外部封裝結構; r. 細胞質大核糖體亞單位; s. 細胞質小核糖體亞單位; t. 質膜固有成分; u. 跨膜轉運蛋白活性; v. 運輸活動; w. 無機分子實體跨膜轉運活性; x. 離子跨膜轉運蛋白活性;? y. 核糖體結構組成; z. 磷酸酶活性; α. 陰離子跨膜轉運蛋白活性; β. 離子反轉運體活性; γ. 二級活性跨膜轉運蛋白活性; δ. 有機陰離子跨膜轉運蛋白活性.

a. 細胞質翻譯; b. 翻譯; c. 酰胺生物合成工藝; d. 多肽生物合成工藝; e. 細胞酰胺代謝過程; f. 肽代謝過程; g. 核糖體生物起源; h. 核糖核蛋白復合物的生物發生; i. 核糖體大亞單位生物發生; j. 細胞質翻譯延伸; k. 胞質核糖體; l. 胞質部分; m. 核糖體亞基; n. 核糖體; o. 細胞質大核糖體亞單位; p. 細胞質小核糖體亞單位; q. 大核糖體亞單位; r. 小核糖體亞單位; s. 濃縮染色體內著絲粒; t. 濃縮染色體; u. 核糖體結構組成; v. 分子結構活性動; w. 核糖體RNA結合; x. 輔助因子跨膜轉運蛋白活性;? y. ATP酶調節活性; z. 蛋白質異源二聚活性性; α. 硫化合物跨膜轉運蛋白活性; β. 翻譯伸長因子活性; γ. 未折疊蛋白結合; δ. 有機陰離子跨膜轉運蛋白活性.

a. 磷酸化; b. 前體代謝產物和能量產生; c. 核苷三磷酸代謝過程; d. 輸入細胞; e. 離子跨膜轉運; f. 嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程；? g. 細胞通訊; h. 三磷酸核糖核苷代謝過程; i. 嘌呤核苷三磷酸代謝過程; j. ATP代謝過程; k. 等離子體膜; l. 肌動蛋白皮質貼片; m. 內吞斑塊; n. 內線粒體膜蛋白復合物; o. 細胞尖端; p. 細胞外區域; q. 細胞分裂位點; r. 細胞器內膜; s. 細胞器包膜； t. 包膜; u. 運輸活動; v. 跨膜轉運蛋白活性; w. 無機分子實體跨膜轉運活性; x. 活躍的跨膜轉運蛋白活性; y. 離子跨膜轉運蛋白活性; z. 磷酸酶活性; α.? 逆向轉運活動; β.? 磷酸酯水解酶活性; γ. 二級活性跨膜轉運蛋白活性; δ.? 質子跨膜轉運蛋白活性.

2.5 差異基因KEGG 富集分析

為進一步研究sgf73基因缺失后細胞分裂異常的關鍵通路，對野生型和sgf73Δ菌株的差異表達基因進行KEGG富集分析，結果表明，有452個差異基因成功富集并注釋在80條通路中，選取上調和下調差異表達基因KEGG富集最顯著的20個通路繪制成柱狀圖和散點圖，如圖7所示. 上調的差異表達基因主要富集在核糖體通路中，如圖8所示.? 在下調的差異表達基因KEGG富集分析中（圖9），差異基因富集在氧化磷酸化、 半乳糖代謝、 精氨酸生物合成、 果糖和甘露糖代謝、 檸檬酸循環（TCA 循環）和MAPK等多條信號通路中，結果列于表5.

野生型和sgf73Δ菌株間差異表達基因的代謝通路富集如圖10所示. 由圖10可見，? 富集最集中的通路為MAPK信號通路，該通路由高度保守的MAPKKK、 MAPKK和MAPK絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，通過蛋白磷酸化方式進行調控，參與真核生物細胞的周期調節、 細胞生長、 分化和凋亡過程. 在該途徑中，有14個基因被顯著富集，下調基因有12個，分別為git5，cki1，cki2，ptc1，ksg1，rgf2，rho1，bgs1，bgs3，gpd1，stt4和cdc25.

a. 核糖體; b. 精氨酸生物合成; c. 丙氨酸、 天門冬氨酸和谷氨酸代謝； d. 半乳糖代謝; e. 果糖和甘露糖代謝； f. 氧化磷酸化; g. 精氨酸和脯氨酸代謝; h. 氨基糖和核苷酸糖代謝;? i. 嘧啶代謝; j. 卟啉和葉綠素代謝; k. 乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝; l. 甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝; m. MAPK信號通路-酵母; n. 檸檬酸循環（TCA循環）; o. 過氧化物酶體; p. 甘油酯代謝; q. 硫胺素新陳代謝; r. 硫代謝; s. 氨基酸生物合成; t. 酪氨酸代謝.

a. 核糖體; b. DNA復制; c. 硫代謝; d. 丙氨酸、 天門冬氨酸和谷氨酸代謝; e. 半胱氨酸和蛋氨酸代謝; f. 精氨酸生物合成; g. 真核生物中的核糖體生物發生; h. 嘧啶代謝; i. 葉酸生物合成; j. 核苷酸切除修復; k. 剪接體; l. 氨基酸生物合成; m. 基底切除修復; n.? 精氨酸和脯氨酸代謝; o. 嘌呤代謝; p. 減數分裂-酵母; q. 賴氨酸生物合成; r. 輔助因子生物合成; s. 各種類型的N-聚糖生物合成; t. 甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸代謝.

a. 氧化磷酸化; b. 半乳糖代謝; c. MAPK信號通路-酵母; d. 精氨酸生物合成; e. 果糖和甘露糖代謝; f. 檸檬酸循環（TCA循環）; g. 自噬-酵母; h. 甘油酯代謝; i. 氨基糖和核苷酸糖代謝; j. 次生代謝產物生物合成; k. 卟啉和葉綠素代謝; l. 類固醇生物合成; m. 酪氨酸代謝; n. 碳代謝; o. 甘油磷酸酯代謝; p. 硫胺素新陳代謝; q. 乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝; r. 淀粉和蔗糖代謝; s. 膜泡輸運中的SNARE相互作用; t. 糖酵解/糖異生.

調控細胞周期和細胞骨架穩定性的cki1，cki2，cdc25等差異基因被顯著富集.

cki1和cki2均屬于CK1 家族激酶，參與調節細胞周期、 染色體分離和細胞分化過程； cdc25基因參與細胞周期的調控，當DNA受損或不完全復制時，該酶下調表達或不表達以阻止細胞周期進展［23］； rgf2和rho1基因同屬于RHO家族基因，其中rho1基因通過與蛋白激酶Pkc1的相互作用控制下游信號通路Pkc1-Mpk1 MAP激酶級聯反應，進而調控細胞在熱休克脅迫條件下肌動蛋白極化過程［24］，而rgf2基因在細胞分裂間期和隔膜期定位于細胞末端，參與調節肌動蛋白細胞骨架和細胞壁合成過程；? stt4編碼的1-磷脂酰肌醇 4-激酶 STT4可補償性調節磷酸肌醇合成，進而調控肌動蛋白細胞骨架組織. 肌動蛋白作為細胞骨架的重要組成部分，是真核細胞中最豐富的蛋白質之一，參與細胞運動、 細胞內囊泡運輸及細胞分裂過程. 在裂殖酵母細胞中， 有adf1（編碼共絲蛋白）和imp2（編碼收縮環蛋白 Imp2）兩種基因； adf1基因缺失導致肌動蛋白解聚速率降低、 收縮環組裝異常和收縮速率降低； imp2基因與小鼠 pstpip1基因（編碼脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶相互作用蛋白）同源，該基因缺失后胞質分裂顯示出缺陷，并影響細胞完整性［16］.? sgf73基因缺失后導致肌動蛋白形成的分裂環在有絲分裂中維持時間極顯著延長，收縮時間顯著延長，導致調控肌動蛋白細胞骨架過程受損. stt4和rgf2基因在sgf73Δ菌株中均下調表達，表明sgf73基因缺失后導致參與肌動蛋白形成分裂環及分裂環收縮的系列過程受損.

在細胞有絲分裂期間，多種關鍵基因功能缺失可導致細胞分裂過程中紡錘體組裝缺陷，細胞極化生長過程受損，如aug7基因編碼Augmin亞基7，該基因突變可導致γ-微管蛋白在有絲分裂紡錘體的定位改變，使紡錘體異常伸長［25］； cut7基因編碼驅動蛋白5，在人類、 果蠅和裂殖酵母中，該基因缺失可導致單極紡錘體的產生和染色體分離失??；? eml3基因編碼微管相關蛋白3，該基因編碼的蛋白被細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk1）磷酸化后，可促進與Augmin亞基和γ-微管蛋白復合物的結合，對紡錘體組裝和著絲粒連接有重要作用，敲除該基因影響紡錘體裝配檢查點，導致染色體聚集和細胞分裂的延遲［26］. sgf73Δ菌株形成點狀紡錘體菌株有顯著差異（P<0.05），形成棒狀和單極紡錘體的菌株與野生型菌株有極顯著差異（P<0.01）.? 表明sgf73基因敲除導致紡錘體形成缺陷，單極紡錘體增加，不利于有絲分裂中染色體的正確分離，導致細胞周期受阻及細胞極化生長受損. cdc25，cki1，cki2基因在sgf73Δ菌株中均下調表達，表明sgf73基因缺失導致細胞周期受阻，細胞極化生長過程受損.

綜上所述，本文通過對粟酒裂殖酵母野生型及sgf73基因敲除型菌株的轉錄組分析，篩選出1 714個差異表達基因，其中934個基因上調，780個基因下調，這些差異基因主要富集在MAPK信號通路中調控菌株產孢、 細胞分裂和維持細胞骨架穩定的過程. 研究表明，sgf73基因參與粟酒裂殖酵母菌株的有性生殖及有絲分裂中紡錘體組裝和肌動蛋白環收縮的過程，為粟酒裂殖酵母菌生長代謝規律研究提供了一定科學依據.

參考文獻

［1］ HOFFMAN C S， WOOD V， FANTES P A. An Ancient Yeast for Young Geneticists：? A Primer on the Schizosaccharomyces pombe Model System ［J］. Genetics， 2015， 201（2）：? 403-423.

［2］ 袁榮美，丁祥，譚秀梅，等. 線粒體外膜轉位酶基因tom70缺失對裂殖酵母細胞動力學的影響 ［J］. 南京師大學報（自然科學版）， 2020，43（3）： 120-128. （YUAN R M， DING X， TAN X M， et al. Loss of tom70 （Translosage of Outer Mitochondiral 70） Results in Changes of Cell Dynamics? in Fission Yeast? ［J］. Journal of Nanjing Normal University （Natural Science Edition）， 2020，43（3）： 120-128.）

［3］ 朱娟娟， 鄭少陽， 李炎杰， 等. 不同釀酒酵母對臍橙果酒發酵特性的影響? ［J］. 南方農業學報， 2017，48（5）：? 870-875. （ZHU J J， ZHENG S Y， LI Y J， et al. Effects of Different Yeasts? on Fermentation Characteristics of Navel Orange Wine? ［J］. Journal of? Southern Agriculture， 2017，48（5）：? 870-875.）

［4］ HSU C H， CHEN Y J， YANG C N. Loss of Function in SAGA Deubiquitinating Module Caused by Sgf73 H93A Mutation：? A Molecular Dynamics Study ［J］. J Mol Graph Model， 2019，91：? 112-118.

［5］ WU P Y， RUHLMANN C， WINSTON F， et al. Molecular Architecture of the S.cerevisiae SAGA Complex ［J］. Mol Cell， 2019，15（2）：? 199-208.

［6］ KHLER A， SCHNEIDER M， CABAL G G， et al. Yeast Ataxin-7 Links Histone Deubiquitination with Gene Gating and Mrna Export ［J］. Nat Cell Biol， 2008， 10（6）：? 707-715.

［7］ YANG H， LIU S， HE W T， et al. Aggregation of Polyglutamine-Expanded Ataxin 7 Protein Specifically Sequesters Ubiquitin-Specific Protease 22 and Deteriorates Its Deubiquitinating Function in the Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase （SAGA） Complex ［J］. J Biol Chem， 2015， 290（36）：? 21996-22004.

［8］ DENG X， ZHOU H， ZHANG G， et al. Sgf73， a Subunit of SAGA Complex， Is Required for the Assembly of RITS Complex in Fission Yeast ［J］. Sci Rep， 2015， 5：? 14707-1-14707-9.

［9］ SHEN Y Q， SHERMAN J W， CHEN X Y， et al. Phosphorylation of CDC25C by AMP-Activated Protein Kinase Mediates a Metabolic Checkpoint during Cell-Cycle G（2）/M-Phase Transition ［J］. J Biol Chem， 2018， 293（14）：? 5185-5199.

［10］ 周幸， 周楠， 余垚， 等. 裂殖酵母SAGA各亞基亞細胞熒光定位分析? ［J］. 遺傳， 2014， 36（2）：? 169-180. （ZHOU X， ZHOU N， YU Y， et al. Subcellular Fluorescence Localization of Analysis of All SAGA Subunits in Fission Yeast （Schizosaccharomyces pombe）? ［J］. Hereditas， 2014，36（2）：? 169-180.）

［11］ 方佩佩，王世清，李靜，等. 耐酒精釀酒酵母大氣壓等離子體誘變條件的建立及選育 ［J］. 釀酒科技， 2016（9）：? 31-37. （FANG P P， WANG S Q， LI J， et al. Establishment? of the Conditions of Atomspheric Plasa-Inducing Mutation of S.cerevisiae and Breeding of an Ethanol-Tolerant Strain? ［J］. Liquor-Making Science & Technology， 2016（9）： 31-37.）

［12］ 宋志強，丁祥，唐賢，等. 松乳菇子實體兩個發育時期的轉錄組分析 ［J］. 浙江農業學報， 2020，32（2）： 337-347. （SONG Z Q， DING X， TANG X， et al. Transcriptome Analysis of Fruiting Bodies of Lactarius deliciosus at Two Developmental Stages? ［J］. Zhejiang Agriculturae Zhejiangensis， 2020，32（2）： 337-347.）

［13］ MORIGASAKI S， SHIMADA K， IKNER A， et al. Glycolytic Enzyme GAPDH Promotes Peroxide Stress Signaling through Multistep Phosphorelay to a MAPK Cascade ［J］. Mol Cell， 2008， 30（1）：? 108-113.

［14］ WIERENGA R K， KAPETANIOU E G， VENKATESAN R. Triosephosphate Isomerase：? A Highly Evolved Biocatalyst ［J］. Cell Mol Life Sci， 2010， 67（23）：? 3961-3982.

［15］ AHN J， WON M， CHOI J H， et al. Small Heat-Shock Protein Hsp9 Has Dual Functions in Stress Adaptation and Stress-Induced G2-M Checkpoint Regulation via Cdc25 Inactivation in Schizosaccharomyces pombe ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2012，417（1）：? 613-618.

［16］ MORITA R， TAKAINE M， NUMATA O， et al. Molecular Dissection of the Actin-Binding Ability of the Fission Yeast α-Actinin， Ain1， in vitro and in vivo ［J］. J Biochem，2017，162（2）：? 93-102.

［17］ MALLET P L， LAROCHELLE M， BACHAND F. Multiple Transcriptional and Post-Transcriptional Pathways Collaborate to Control Sense and Antisense RNAs of Tf2 Retroelements in Fission Yeast ［J］. Genetics， 2017， 205（2）：? 621-632.

［18］ FRANCOIS M， DONOVAN P， FONTAINE F. Modulating Transcription Factor Activity：? Interfering with Protein-Protein Interaction Networks ［J］. Semin Cell Dev Biol， 2020，99：? 12-19.

［19］ FUKUNISHI K， MIYAKUBI K， HATANAKA M， et al. The Fission Yeast Spore Is Coated by a Proteinaceous Surface Layer Comprising Mainly Isp3 ［J］. Mol Biol Cell， 2014，25（10）：? 1549-1559.

［20］ MATSUDA E， SUGIOKA-SUGIYAMA R， MIZUGUCHI T， et al. A Homolog of Male Sex-Determining Factor SRY Cooperates with a Transposon-Derived CENP-B Protein to Control Sex-Specific Directed Recombination ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011，108（46）：? 18754-18759.

［21］ KHALAJ V， AZIZI M， ENAYATI S， et al. NCE102 Homologue in Aspergillus fumigatus Is Required for Normal Sporulation， Not Hyphal Growth or Pathogenesis ［J］. FEMS Microbiol Lett， 2012， 329（2）：? 138-145.

［22］ YAMAOKA T， IMADA K， FUKUNISHI K， et al. The Fission Yeast Synaptobrevin Ortholog Syb1 Plays an Important Role in Forespore Membrane Formation and Spore Maturation ［J］. Eukaryot Cell， 2013， 12（9）：? 1162-1170.

［23］ KARLSSON-ROSENTHAL C， MILLAR J B. Cdc25：? Mechanisms of Checkpoint Inhibition and Recovery ［J］. Trends Cell Biol， 2006，16（6）：? 285-292.

［24］ NOMURA W， INOUE Y. Contribution of Phosphatidylserine to Rho1- and Pkc1-Related Repolarization of the Actin Cytoskeleton Under Stressed Conditions in Saccharomyces cerevisiae ［J］. Small GTPases， 2019， 10（6）：? 449-455.

［25］ HOTTA T， KONG Z， HO C M， et al. Characterization of the Arabidopsis augmin Complex Uncovers Its Critical Function in the Assembly of the Acentrosomal Spindle and Phragmoplast Microtubule Arrays ［J］. Plant Cell，2012，24（4）：? 1494-1509.

［26］ LUO J， YANG B Y， XIN G W， et al. The Microtubule-Associated Protein EML3 Regulates Mitotic Spindle Assembly by Recruiting the Augmin Complex to Spindle Microtubules ［J］. J Biol Chem， 2019，294（14）：? 5643-5656.

（責任編輯： 單 凝）