繡球菌凍干片對S180 荷瘤小鼠抗腫瘤作用

徐媛媛，陳 萌，徐曉飛

（廣東海洋大學食品科學與工程學院，廣東 陽江 529500)

食用菌有悠久的食用和藥用歷史，因其富含纖維、多種營養素、美味和低熱量而廣受歡迎，許多體外和動物研究報告了食用菌的保健作用，如免疫調節、抗氧化等[1]。繡球菌是近年來人工培育成功的一種新興食用菌，子實體呈白色或淡黃色，外形似繡球，又名為花椰菜菇，野生資源非常稀少，是名貴食藥用菌[2]，在生物學分類上隸屬繡球菌科（Sparassisidaceae）繡球菌屬（Sparassis）[3]。研究發現，繡球菌中含有高比例高分子多糖、氨基酸和豐富的礦物質和維生素[4]，此外還有多酚類、黃酮類、萜類、生物堿、鄰苯二甲酸酯等活性成分[5]，特別是β-(1,3)-葡聚糖的含量非常豐富。日本食品分析化驗所測得β-(1,3)-葡聚糖含量為43.5 g/100 g干重[2]；我國學者報道繡球菌柄部和瓣片部分的含量分別為54%和56%，極顯著高于猴頭菇、香菇、蛹蟲草和草原黃蘑菇[6]，為已知食用菌之最。因此，對食用菌進行深加工有利于開發食用菌資源，發揮其活性成分豐富的優勢[7]。

近年來，我國腫瘤患者數量持續增長，給社會醫療系統帶來巨大負擔[8]。機體免疫功能特性與狀態在腫瘤的發生、發展以及轉移過程中具有重要的作用[9]。因此，增強腫瘤病人的免疫功能成為提高抗腫瘤治療效果的一個重要手段。在眾多具有激活機體免疫系統、提高免疫功能的天然活性物質中，β-(1,3)-葡聚糖具有來源廣泛、活性強、耐受性好、副作用小等特點[10]，已經有超過10 000 項在同行評審期刊上發表的科學研究[11]，也是眾多臨床試驗的對象[12]。繡球菌是β-(1,3)-葡聚糖的良好來源，日本學者用繡球菌粉喂食接種S180 腫瘤細胞的小鼠5 周后，發現腫瘤重量明顯比對照組小，且小鼠生存時間延長[13]，提示繡球菌可應用于輔助抑制腫瘤食品。在前期研究中，通過將繡球菌子實體粉碎結合微壓提取方式，開發了一種繡球菌深加工標準化原料，并取得了食品原料標準備案[廣東省食品安全企業標準《繡球菌濃縮液》（Q/WQYS 0083 S—2022），備案號：44020005S-2023][14]。為方便加工使用，進一步將濃縮液凍干制得凍干片[廣東省食品安全企業標準《繡球菌凍干片（壓片糖果）》（Q/WQYS 0088 S—2023），備案號：44020023S-2023]。本試驗通過建立S180 荷瘤小鼠模型，探究繡球菌凍干片對S180 腫瘤的抑制作用，檢測小鼠細胞免疫和體液免疫功能指標變化，分析腸道中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）水平，旨在為繡球菌凍干片的抗腫瘤作用及機理提供試驗證據，也為食用菌深加工方向提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

4～8 周齡BALB/C 小鼠，雄性SPF 級100 只購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2022－0002，實驗動物質量合格證號№440072001202044。動物實驗環境：廣東省中醫藥工程技術研究院SPF 級動物實驗室，設施使用許可證號：SYXK（粵）2020-0059。試驗倫理由廣東省第二中醫院試驗動物倫理委員會批準（049176）。

1.2 材料與試劑

繡球菌凍干片（0.5 g/片×3片/袋，每100 g含β-1,3-葡聚糖10.7 g），批號：20230501，本研究團隊研發并由上海雪榕源生物有限公司制造，推薦服用量1.5 g·d-1。破壁靈芝孢子粉膠囊（0.3 g/?！?0粒，每100 g含多糖1 g，總三萜3 g），批號：2301091P142，廣州白云山漢方現代藥業有限公司，推薦服用量1.8 g·d-1。茯苓多糖口服液（每100 mL 含茯苓多糖1.6 g），批號：20230601，湖南補天藥業股份有限公司，臨床治療推薦服用量30 mL·d-1。乙酸（純度99.8%）、丙酸（純度99.5%）、異丁酸（純度99.5%）、丁酸（純度99.5%）、異戊酸（純度99%）、戊酸（純度99%），上海麥克林公司。

S180 細胞、L929 細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；1640 培養基，上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清，維森特生物技術（南京）有限公司產品；CCK-8 試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；刀豆凝集素ConA，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；小鼠白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒，江蘇酶免實業有限公司。

1.3 儀器與設備

小型高速離心機（5450 型），德國Eppendorf 公司；電子天平（BSA2245 型），賽多利斯科學儀器有限公司；Varsoskan Flash 多功能酶標儀，美國Thermo 公司；倒置顯微鏡（DMi1 型），Leica 公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀，島津儀器公司；DB-FATWAX 毛細管色譜柱，安捷倫儀器公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 S180 細胞培養

S180 細胞復蘇后用含10%胎牛血清的培養基于5%CO2、37 ℃培養箱中培養，染色鑒定活細胞數≥95%，隨后用培養液調整至106個/mL 濃度。

1.4.2 S180 荷瘤小鼠模型建立與試驗分組

取50 只小鼠腹腔注射S180 細胞，接種7 d 后，在無菌條件下取荷瘤小鼠的腹水與生理鹽水按1 ∶3 的比例稀釋至2×107～3×107個/mL 濃度。然后對剩余50 只小鼠右腋皮下注射0.2 mL 腹水稀釋液，建立S180 荷瘤小鼠模型[15]，隨后按表1 將小鼠隨機分為5 組，每組10 只。本實驗以造模當天記為第“0 d”，造模次日，口服灌胃給藥體積0.2 mL，1 次/天，持續18 d。

表1 S180 荷瘤小鼠分組與灌胃劑量設計表

1.4.3 荷瘤小鼠體質量、瘤體質量、瘤體指數和體積測定

每天觀察并記錄小鼠的活動情況，在第2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d 測定小鼠的體重。給藥18 d 后斷頸處死小鼠，剖取腫瘤測定瘤重，按式（1）計算瘤體指數。

式中：m1為腫瘤質量，mg；m2為小鼠體重，g。

用游標卡尺測量腫瘤尺寸并按式（2）計算瘤體體積。

式中：D為腫瘤最大直徑，cm，d為腫瘤最小直徑，cm[16]。

1.4.4 腫瘤抑制率的測定

根據式（3）計算各樣品的腫瘤抑制率。

式中：M為模型組瘤重與小鼠體重的比值；N為試驗組瘤重與小鼠體重的比值[15]。

1.4.5 白細胞計數、細胞因子和臟器指數的測定

結束實驗后，小鼠麻醉后進行眼眶采血，測定白細胞數量；4 ℃、3 000 r·min-1離心l0 min 收集血清，按ELISA 試劑盒操作方法分別測定小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平。無菌剖取小鼠胸腺、脾臟，準確稱重并計算胸腺/脾臟指數：臟器指數=臟器重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.4.6 脾淋巴細胞增殖活性和脾NK 細胞殺傷活性測定

按照文獻制備脾細胞懸液[17]，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液調整細胞數為2×106/mL 后，將細胞懸液加入細胞培養板（0.2 mL/孔），加7.5 μg·mL-1ConA（0.01 mL/孔），以未加ConA孔作對照孔，5%CO2、37 ℃飽和濕度下培養24 h，于培養結束前1 h 左右，每孔吸棄100 μL 培養液上清后加入CCK-8（0.01 mL/孔），并設RPMI1640培養液空白對照，各處理均采用3個復孔。用酶標儀450 nm 波長測定每孔OD值。脾淋巴細胞增殖活性=（刺激孔OD值/對照孔OD值）×100%。

同上法制備脾細胞懸液，按文獻報道方法測定脾NK 細胞殺傷活性[18]。

1.4.7 小鼠結腸內容物中短鏈脂肪酸SCFAs 的測定

無菌剖取小鼠腸組織，于冰上切開腸組織，無菌PE管收集每只小鼠結腸內容物，標記后速凍、-80 ℃保存。按照文獻方法檢測內容物中6 種短鏈脂肪酸的濃度[19]。

1.5 統計方法

所有計量資料以平均數加減標準差（x-±s）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），相關性分析采用Pearson，由SPSS22.0 軟件完成，P＜0.05 代表有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 試驗樣品對小鼠體重的影響

如圖1 所示，給藥前各組小鼠體重無明顯差異（P＞0.05）；試驗過程中，荷瘤模型組小鼠體重呈現先上升后下降的趨勢，GS 和PCP 組體重變化趨勢與模型組相似（16 d 前）；SCL 和SCH 組體重開始增長緩慢然后明顯增加，16 d 后，SCL 和SCH 組小鼠體重均比GS 和PCP 組高。

圖1 試驗期間各組小鼠平均體重的變化圖

2.2 試驗樣品對小鼠存活率和腫瘤生長的影響

試驗結束后，Model、GS、PCP、SCL 和SCH 組分別有4 只、2 只、1 只、2 只和2 只小鼠死亡，各組存活率和對腫瘤抑瘤作用見表2。各試驗樣品均對S180腫瘤生長有一定抑制作用；從瘤體指數分析，與模型組相比，各試驗樣品均對S180 瘤體指數有極顯著的影響，GS 組和SCH 組的抑制效果相當，PCP 組和SCL組的抑制效果相當；從瘤體體積來看，PCP 組和SCL組的抑制效果相當。SCL 組與SCH 組結果反映了繡球菌凍干片對腫瘤抑制作用具有劑量依賴性，高劑量優于低劑量。

表2 荷瘤小鼠存活率和試驗樣品對腫瘤抑制作用表

2.3 試驗樣品對荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.3.1 臟器指數

白細胞是機體外周血中各種免疫細胞的統稱，包括T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、B 細胞等。免疫器官臟器指數一定程度反映了整體免疫功能強弱。由圖2 可知，各樣品對荷瘤小鼠的白細胞數量無顯著影響，對脾臟指數有一定提高作用，其中SCH 組顯著高于Model 組和PCP 組，說明高劑量繡球菌凍干片能明顯提高脾臟指數；各樣品均能極顯著提高荷瘤小鼠的胸腺指數，但各試驗組間無統計學差異。

圖2 試驗樣品對荷瘤小鼠白細胞計數和臟器指數的影響圖

2.3.2 細胞因子水平

細胞因子水平反映了體液免疫功能的變化，對荷瘤小鼠外周血細胞因子水平的影響見圖3。在IL-2 水平上，PCP、SCL 和SCH 組顯著高于Model 組，然而各樣品對IL-6 和IL-8 作用不明顯，但可以顯著或極顯著提升TNF-α 水平，其中SCH 組提升程度最大。綜上所述，靈芝孢子粉、茯苓多糖和繡球菌凍干片能夠提高荷瘤小鼠IL-2 和TNF-α 水平。

圖3 試驗樣品對荷瘤小鼠細胞因子水平的影響圖

2.3.3 細胞活性指標

脾淋巴細胞增殖活性和脾NK 細胞殺傷活性反映了機體細胞免疫功能。由圖4 可知，相比模型組，GS 組脾淋巴細胞增殖活性有提升但無統計學意義，而PCP、SCL 和SCH 組顯著增強（P＜0.01）；同時，各樣品也顯著提升了荷瘤小鼠的NK 細胞殺傷活性，其中以SCH 組提升程度最高。

圖4 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖和NK 細胞殺傷活性的影響圖

綜合臟器指數、細胞因子水平和細胞活性指標，靈芝孢子粉、茯苓多糖和繡球菌凍干片均具有提高荷瘤小鼠體液免疫和細胞免疫功能的作用。繡球菌凍干片對荷瘤小鼠的免疫增強作用存在劑量依賴性，以高劑量繡球菌凍干片的效果為好。

2.4 試驗樣品對腸道SCFAs 濃度的影響

為考察試驗樣品對腸道菌群代謝的影響，采用GC-MS 檢測了小鼠結腸內容物中6 種SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和正戊酸）的濃度。Model、GS 和PCP 組各有一只小鼠的結腸內容物中未檢測出SCFAs，繡球菌凍干片高低劑量組小鼠均可檢出，數據結果如圖5 所示。與模型組相比，各樣品組小鼠的6 種SCFAs 濃度有增加的趨勢但無統計學差異，總SCFAs 濃度也呈現類似的結果，其中繡球菌凍干片SCL 和SCH 組 總SCFAs 分別為（3.40±0.24）mg·g-1和（3.42±0.12）mg·g-1，提示繡球菌凍干片的劑量對SCFAs 的濃度無明顯影響。

圖5 試驗樣品對荷瘤小鼠結腸內SCFAs 濃度的影響圖

2.5 免疫功能指標與抑制腫瘤作用的相關性

為探索免疫指標與腫瘤抑制效果的關系，利用Pearson 進行相關性分析，如圖6 所示，瘤體指數與IL-2、TNF-α 水平的Pearson 相關系數（R）分別為-0.538 和-0.536（P＜0.01），表明瘤體指數與兩種細胞因子濃度具有中等程度的負相關性。

圖6 免疫功能指標與瘤體指數的相關性圖

3 討論

靈芝是我國傳統的食藥兩用真菌，孢子是靈芝的生殖細胞。三萜類化合物和多糖是靈芝孢子粉的主要活性成分[20]，眾多研究表明靈芝孢子粉可以通過促進淋巴細胞的增殖、增強巨噬細胞功能、促進NK 細胞活性和提高細胞因子分泌，以及調控程序性細胞死亡蛋白1 表達和調節腸道菌群平衡，從而發揮免疫調節活性，實現增強機體免疫功能和抗腫瘤作用[21]。茯苓多糖占茯苓菌核重量的70%～90%，體內外實驗證明茯苓多糖通過調節細胞免疫和體液免疫功能、誘導細胞凋亡、抑制侵襲轉移發揮抗腫瘤作用[22-23]。繡球菌中富含β-1,3-葡聚糖[2]，從繡球菌中分離得到的β-1,3-葡聚糖在20～500 mg·kg-1劑量范圍注射S180荷瘤小鼠，可在小鼠體內抑制腫瘤的生長并呈現量效關系[24]；從繡球菌中提取獲得的多糖，通過破壞細胞膜的完整性抑制人類結腸癌細胞系Caco-2、LS180 和HT-29 的增殖，表現出抗結腸癌的潛力[25]；繡球菌多糖也可誘導白血病細胞K562、THP-1 細胞的凋亡[26]。此外，繡球菌多糖能提高免疫低下小鼠的脾臟指數，增加白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞及血小板數量，增強T 淋巴細胞增殖能力，促進脾免疫細胞分泌IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B、穿孔素和IL-2，抑制IL-10 的分泌，證明繡球菌多糖可提高免疫低下小鼠細胞免疫和體液免疫功能[27]。由此可見，繡球菌凍干片的抗腫瘤作用與繡球菌多糖的增強免疫功能、抗腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡密切相關。同時，繡球菌中除多糖類成分外，還有其他成分如蛋白質和多酚類成分[5]。食用菌中蛋白質和多酚成分也具有免疫調節作用，同時不同成分之間也可能存在協同作用[28]。然而，有關繡球菌中蛋白質和多酚的免疫調節作用和機理暫無報道，有待未來的進一步研究。

本研究中，Pearson 相關性分析發現腫瘤指數與IL-2、TNF-α 濃度呈負相關。IL-2 是T 淋巴細胞和NK 細胞增殖和分化的刺激因子[29]，IL-2 可調節CD4+T 細胞分化和功能，也調控與癌癥免疫治療有關的CD8+T 細胞的殺傷效應和記憶反應[30]，CD8+T 細胞主要是細胞毒性T 淋巴細胞，具有殺傷包括被病原體感染的體細胞和腫瘤細胞的作用。TNF-α 主要由激活的巨噬細胞產生，TNF-α 通過與腫瘤細胞表面腫瘤壞死因子受體1（Tumor Necrosis Factor Receptor 1，NFR1）或TNFR2 結合，激活與細胞凋亡相關核轉錄因子NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信號通路，發揮抗腫瘤作用[31]。眾多研究表明β-葡聚糖可激活中性粒細胞、巨噬細胞、NK 細胞和樹突細胞，刺激細胞因子包括白介素IL-2 和TNF-α 的分泌，誘導細胞凋亡和阻斷血管生成等多途徑發揮抗腫瘤作用[32]。本試驗中，試驗樣品增加了荷瘤小鼠細胞因子IL-2 和TNF-α 濃度，有助于提升抗腫瘤效果，與前人研究結果相符。

SCFAs 是腸道菌群的代謝物之一，具有調節宿主免疫細胞發育、分化和免疫系統功能的作用[33]。眾多研究表明，食用菌多糖可以調節腸道菌群組成和促進SCFAs 的產生[34]。在本研究中，灌胃茯苓多糖、繡球菌多糖對結腸部位6 種SCFAs 和總SCFAs 濃度無明顯影響，表明試驗樣品對荷瘤小鼠免疫功能的調節作用可能是通過非SCFAs 依賴途徑來實現。在小腸部位，由腸上皮細胞、固有層免疫細胞和派氏結等組成腸黏膜免疫系統是識別和響應外來抗原物質的主要系統[35]，多糖可以通過免疫受體介導與黏膜免疫系統作用而調節整體免疫系統功能[36]，由此說明，食用菌多糖可以通過多種途徑實現免疫調節作用。

4 結論

本文采用S180 荷瘤小鼠模型評價繡球菌凍干片的抗腫瘤潛力和小鼠免疫功能指標的變化，推測繡球菌凍干片可能是通過提高荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數，促進細胞因子IL-2 和TNF-α 分泌，增強脾淋巴細胞增殖能力和NK 細胞殺傷活性來抑制S180腫瘤生長并提高荷瘤小鼠生存率。本研究結果可以為繡球菌應用于提高免疫功能相關的功能食品開發提供參考。