利用PCR 技術(shù)檢測(cè)BoHV-1 病毒的研究進(jìn)展

李寧晰，顧文源，倪俊卿，馬亞賓，朱禮倩，丁秀艷★

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050026；3.河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050035）

1 牛皰疹病毒1 型

牛皰疹病毒1 型（Bovine herpes virus 1，Bo-HV-1）是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科成員。 牛是BoHV-1 感染的自然宿主，在全球廣泛流行和分布，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，美國(guó)養(yǎng)牛業(yè)因該病毒每年損失約30 億美元。

通常BoHV-1 病毒感染引起呼吸道、 生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。 其潛伏期通常為2～7 天。其臨床癥狀主要包括呼吸系統(tǒng)炎癥、高燒、結(jié)膜炎、鼻孔發(fā)炎、呼吸困難、生殖器官病變潰瘍以及子宮炎癥等。 重要的是BoHV-1 感染還可以導(dǎo)致免疫抑制，從而導(dǎo)致繼發(fā)性細(xì)菌感染，引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合癥（BRDC），是引起幼畜死亡的重要原因之一。 急性感染后會(huì)建立持續(xù)終生的潛伏感染，長(zhǎng)途運(yùn)輸、疾病和用藥等均能激活潛伏感染的病毒， 從而產(chǎn)生具有感染性的病毒并引起發(fā)病。

大量流行病學(xué)調(diào)查表明BoHV-1 在我國(guó)廣泛分布，并造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。 開發(fā)簡(jiǎn)便、快速并且適合大范圍應(yīng)用的病毒檢測(cè)技術(shù)對(duì)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義， 本文就目前常用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BoHV-1 感染的常用方法及PCR 檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BoHV-1 感染的技術(shù)較多，例如細(xì)胞培養(yǎng)、組織病理學(xué)、血清學(xué)、病毒分離鑒定、 電子顯微鏡和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是利用BoHV-1 感染細(xì)胞造成的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的特征性，通過(guò)觀察CPE 來(lái)進(jìn)行檢測(cè)， 需要細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)且檢測(cè)的準(zhǔn)確性較低； 組織病理學(xué)通過(guò)檢測(cè)組織樣本中病毒基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)對(duì)BoHV-1 感染進(jìn)行檢測(cè)，由于這類病毒裂解性感染是暫時(shí)性的，故組織學(xué)檢測(cè)具有時(shí)間局限性； 電子顯微鏡技術(shù)可以通過(guò)識(shí)別細(xì)胞樣本中病毒顆粒從而快速檢測(cè)BoHV-1 感染，但其準(zhǔn)確性同樣較低；病毒分離鑒定是BoHV-1 感染常用檢測(cè)方法，但病毒分離的條件比較苛刻， 病毒失活以及分離時(shí)間過(guò)久都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果， 且病毒分離鑒定僅限于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，很難進(jìn)行大規(guī)模的臨床樣品檢測(cè)；血清學(xué)測(cè)試則通過(guò)利用多種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)感染牛的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，相較于前面所述的幾種方法，ELISA 技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單方便，也是目前應(yīng)用較多的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)。 但是該方法所用試劑盒主要依賴進(jìn)口產(chǎn)品， 價(jià)格較高，不適合大量臨床樣品檢測(cè)。

對(duì)比上述幾類檢測(cè)技術(shù)，PCR 方法具有便捷、靈敏度更高、成本低等優(yōu)勢(shì)，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。 PCR 方法所具有的高度靈敏性使其在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)于樣品的要求更低，利用眼鼻拭子、精液、腦組織等樣品均可以進(jìn)行檢測(cè)。 不同種類的PCR 技術(shù)（如熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR 等）也可以滿足不同條件下的檢測(cè)需求， 并且檢測(cè)成本以及檢測(cè)環(huán)境的要求也相對(duì)較低，適用于大規(guī)模檢測(cè)。

3 不同PCR 方法檢測(cè)BoHV-1 研究現(xiàn)狀

3.1 常規(guī)PCR 技術(shù)

常規(guī)的PCR 技術(shù)是相對(duì)簡(jiǎn)便的基因片段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法， 也是最早被嘗試應(yīng)用于檢測(cè)Bo-HV-1 感染的方法之一。 常規(guī)PCR 通過(guò)設(shè)計(jì)與BoHV-1 病毒基因片段的特異性結(jié)合引物，確定最佳反應(yīng)條件（如退火溫度、延伸時(shí)間等），準(zhǔn)確擴(kuò)增對(duì)應(yīng)病毒基因片段，通過(guò)凝膠電泳直觀準(zhǔn)確的顯示檢測(cè)結(jié)果。

盡管常規(guī)PCR 是成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在實(shí)際檢測(cè)中很難順利擴(kuò)增BoHV-1 基因片段，其原因可能在于BoHV-1 基因組中富含CG 堿基，故在引物設(shè)計(jì)以及目的片段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)過(guò)程中難以對(duì)退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化， 常規(guī)PCR 實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的特異性降低， 從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)非目的條帶，甚至可能出現(xiàn)無(wú)法擴(kuò)增目的DNA 片段的情況， 這限制了PCR 技術(shù)在BoHV-1 臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。

3.2 巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）也稱為套式聚合酶鏈反應(yīng)， 是一種在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 可以在常規(guī)PCR 特異性偏低的情況下用于PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 這種實(shí)驗(yàn)方法需要設(shè)計(jì)兩對(duì)不同的PCR 引物，第一對(duì)引物用于對(duì)目的DNA片段進(jìn)行常規(guī)的PCR 擴(kuò)增， 然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板， 利用第二對(duì)引物 （被稱為巢式引物），擴(kuò)增一條相對(duì)更短的DNA 片段，可以排除第一輪常規(guī)PCR 擴(kuò)增中出現(xiàn)的非特異性條帶，通過(guò)巢式PCR 技術(shù)可以提高PCR 擴(kuò)增的特異性。

利用巢式PCR 可以解決常規(guī)PCR 檢測(cè)Bo-HV-1 病毒感染實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的非特異性片段擴(kuò)增問(wèn)題，從而提高PCR 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)提高其準(zhǔn)確性。 目前巢式PCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，并應(yīng)用于多種病毒的檢測(cè)。 研究顯示在病毒感染后， 在抗體產(chǎn)生之前即可通過(guò)巢式PCR 檢測(cè)到精液等樣品中的BoHV-1。 當(dāng)前已經(jīng)有研究利用巢式PCR 檢測(cè)牦牛樣本中BoHV-1 感染。隨著研究的深入， 巢式PCR 技術(shù)檢測(cè)BoHV-1核酸具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種常用于通過(guò)對(duì)感染病原微生物基因或其mRNA 表達(dá)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)帶有熒光標(biāo)記的探針對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行特異性標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR 反應(yīng)過(guò)程，隨著目的片段的擴(kuò)增，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，從而獲得循環(huán)閾值（CT）等相關(guān)數(shù)據(jù)，用于計(jì)算分析待檢基因的拷貝數(shù)等所需結(jié)果。國(guó)外已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已建立了利用熒光定量PCR 對(duì)BoHV-1 臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。

相較于血清學(xué)等檢測(cè)方法， 熒光定量PCR具有可再現(xiàn)性、 高特異性和高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，縮短了檢測(cè)時(shí)間， 并實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因進(jìn)行定量的檢測(cè)。 研究表明熒光定量PCR 技術(shù)可以區(qū)分Bo-HV-1 與BoHV-5。 此外在基礎(chǔ)研究中也可以利用熒光定量PCR 檢測(cè)BoHV-1 基因表達(dá)變化情況。

3.4 其他PCR 相關(guān)檢測(cè)方法

除上述幾類常用的PCR 檢測(cè)方法外， 還有其他PCR 檢測(cè)技術(shù)被用于檢測(cè)BoHV-1 檢測(cè)及相關(guān)基礎(chǔ)研究。 例如多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Multiplex PCR Assay），可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作在同一的反應(yīng)體系中使用多對(duì)引物，在檢測(cè)BoHV-1感染的同時(shí)分別檢測(cè)與BoHV-1 致病相關(guān)的多種其他牛病病毒，以實(shí)現(xiàn)對(duì)病畜感染情況進(jìn)行快速定性檢測(cè)，目前這種方法經(jīng)已經(jīng)可以用于檢測(cè)并區(qū)分4 種與BoHV-1 相關(guān)的病毒。另外有研究表明PCR 檢測(cè)可以與southern 印跡雜交技術(shù)結(jié)合，具有更高的敏感性，可用于檢測(cè)精液等樣本中的BoHV-1 病毒。 這些PCR 技術(shù)為PCR 檢測(cè)BoHV-1 感染提供了更多選擇。

4 總結(jié)與展望

BoHV-1 作為一種以牛作為唯一自然宿主的病原體，病毒感染主要引起呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病，并對(duì)病畜造成免疫抑制，影響病畜種群的經(jīng)濟(jì)效益。研發(fā)更加高效準(zhǔn)確且適用于對(duì)大規(guī)模臨床樣品進(jìn)行BoHV-1 檢測(cè)的產(chǎn)品， 將對(duì)BoHV-1 進(jìn)行高效防控提供重要保障，而在諸多檢測(cè)技術(shù)中，PCR 技術(shù)是一個(gè)較好的選擇。

相較于其他常用的檢測(cè)方法 （如病毒分離鑒定、ELISA 檢測(cè)等），PCR 檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)于待檢樣品的量需求較少， 檢測(cè)周期相對(duì)較短，檢測(cè)成本較低，可以應(yīng)對(duì)數(shù)量較多、規(guī)模較大的檢測(cè)需求。 不同種類的PCR 技術(shù)也可以滿足不同條件下的檢測(cè)需求。 盡管如此，PCR 在檢測(cè)BoHV-1 感染方面仍有一些問(wèn)題需要解決，例如PCR 檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但容易受到實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作等方面的干擾而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差，因此，進(jìn)一步提高PCR 檢測(cè)效率、 準(zhǔn)確性和提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性才能進(jìn)一步提高PCR 技術(shù)在BoHV-1 檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值?？傊?，利用PCR 檢測(cè)BoHV-1 的技術(shù)正在不斷完善，隨著研究的推進(jìn)，PCR 檢測(cè)技術(shù)可以為BoHV-1 病毒防治工作提供更加便捷高效的檢測(cè)方法。