zeste 基因增強子同源物2 與卵巢癌關系的研究進展△

蓋敏雪，劉鳴，李長忠

1山東大學齊魯醫學院，濟南 250000

2山東省立醫院婦科，濟南 250000

3北京大學深圳醫院婦產科，廣東深圳 518000

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，其病死率較高，近年來引起了人們的廣泛關注。據統計，全球每年約有20 萬女性死于卵巢癌[1]。由于卵巢癌早期發現困難，超過75%的患者確診時發展為晚期，5 年生存率不到30%[2]。因此，探索卵巢癌發生發展及耐藥的確切機制是迫切需要解決的問題。zeste 基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是表觀遺傳修飾因子之一，是多梳抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的成員之一，通常參與轉錄抑制。EZH2 是PRC2的催化亞基，可以通過催化組蛋白3 上賴氨酸27的三甲基化來改變基因表達[3]。在卵巢癌中，EZH2 通常過表達，因此可能成為有效的治療靶點。本文對EZH2 與卵巢癌發生發展及耐藥的關系進行綜述，重點描述其介導細胞代謝新途徑，以及與微小RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的相互作用，還強調了其與鉑類耐藥的關系及與多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP- ribose）polymerase，PARP]抑制劑的相互作用。

1 EZH2 的結構與功能

EZH2 是PRC2 的催化亞基，PRC2 包含EZH1和EZH2 兩個催化亞基，EZH2位于染色體7q35。EZH2 蛋白包含4 個高度保守的結構域，其中SET結構域可催化組蛋白3 上賴氨酸27 的三甲基化。EZH1 和EZH2 有部分功能重疊，但EZH1 和EZH2的不同之處在于，PRC2-EZH2 在快速增殖的細胞中較為豐富，它能夠催化組蛋白3 上賴氨酸27 的三甲基化，形成H3K27me3，從而誘導靶基因的轉錄抑制；而PRC2-EZH1 經常存在于未分裂的細胞中，負責恢復EZH2的轉錄抑制[4]。EZH2 在多種惡性腫瘤中表達上調，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤，已被證明在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、新生血管生成和化療耐藥中發揮關鍵作用[5-6]。

2 EZH2 參與卵巢癌發生發展的機制

2.1 EZH2 與IncRNA

lncRNA 在卵巢癌發生發展過程中的作用已引起研究者的廣泛關注，其參與了卵巢癌的多種生理和病理過程。Zhang 等[7]研究探討了EZH2 介導的人αβ水解酶結構域蛋白11（abhydrolase domain containing 11，ABHD11）反義RNA1（ABHD11 antisense RNA 1，ABHD11-AS1）啟動子在卵巢癌發病機制中的作用，該研究證實了H3K27me3 與ABHD11-AS1 啟動子的結合部位，ABHD11-AS1 在卵巢癌組織中表達顯著上調，其表達水平與卵巢癌的淋巴結轉移、腫瘤分期及患者的3 年生存率密切相關；敲低ABHD11-AS1 可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。該研究還表明，miRNA-133a-3p 過表達可顯著增強ABHD11-AS1基因敲除對卵巢癌細胞惡性特征的影響，而miRNA-133a-3p 表達恢復則可消除ABHD11-AS1 基因過表達對卵巢癌細胞生長和轉移的影響。表明EZH2 可能通過miRNA-133a-3p 介導H3K27me3 與ABHD11-AS1啟動子結合，從而調控卵巢癌的進展。

UNC5B 反義RNA1（UNC5B antisense RNA 1，UNC5B-AS1）是新發現的一種在甲狀腺乳頭狀癌中致癌的lncRNA，但其在卵巢癌中的作用尚不清楚。Wang 等[8]研究探討了UNC5B-AS1 在卵巢癌中的作用及機制，通過基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）發現，在卵巢癌樣本中UNC5B-AS1 表達上調，并經定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）證實，UCN5B-AS1 的缺失抑制了卵巢癌細胞增殖并促進了細胞凋亡。該研究還發現，UNC5B-AS1 能夠與EZH2 相互作用，觸發N-myc 下游調控基因NDRG家族成員2（NDRG family member 2，NDRG2）啟動子上的H3K27me3，并在表觀遺傳水平抑制NDRG2的表達。說明UNC5B-AS1 通過EZH2 調節NDRG2 上的H3K27me3，從而促進卵巢癌發展，提示UNC5B-AS1 是治療卵巢癌的潛在分子靶點。

Chen 和An[9]的研究發現，與癌旁正常組織相比，卵巢癌組織中lncRNA ATB表達升高，且其高表達與卵巢癌患者的預后不良有關；沉默lncRNA ATB 的表達可抑制卵巢癌SKOV3 和A2780 細胞增殖、遷移和侵襲；RNA 免疫沉淀和RNA 下拉實驗表明，lncRNA ATB通過直接與EZH2相互作用正向調節EZH2的表達，從而促進卵巢癌的發生發展。

氯胺酮被廣泛用于治療癌因性疼痛，并已被證明能夠抑制多種腫瘤的生長，然而其對卵巢癌細胞影響的報道甚少。Li 等[10]研究發現，氯胺酮對6種卵巢癌細胞株的增殖有明顯的抑制作用，并可誘導卵巢癌細胞周期停滯、凋亡，該研究還對基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫進行了生物信息學分析，發現氯胺酮能夠調節lncRNA 漿細胞瘤變異體易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）表達，還可促進p300 介導的PVT1 啟動子中H3K27 乙酰化激活，PVT1 能夠與EZH2 結合，并調節包括p57在內的靶基因表達，從而改變卵巢癌細胞的生物學特性。

2.2 EZH2 與環狀RNA（circuIar RNA，circRNA）

Yang 等[11]研究發現，hsa_circ_0026123 在卵巢癌組織和細胞系中表達上調，而沉默hsa_circ_0026123 的表達能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，并抑制體內和體外腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）相關標志物的表達；應用熒光素酶報告基因檢測系統分析hsa_circ_0026123、miRNA-124-3p 與EZH2的相關性，結果表明，hsa_circ_0026123表達下調通過miRNA-124-3p 的“海綿體機制”抑制EZH2 的表達，從而抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，該方法可用于卵巢癌的靶向治療。

2.3 EZH2 與miRNA

miRNA let-7b 是一種有效的腫瘤抑制因子，Kuang 等[12]研究發現，賴氨酸去甲基化酶2B（lysine demethylase 2B，KDM2B）通過使H3K36me2 去甲基化直接抑制let-7b 的表達；增殖、遷移和傷口愈合實驗表明，let-7b 能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，EZH2沉默逆轉了抑制let-7b 介導的促腫瘤生長作用。因此，在卵巢癌中let-7b 的表達受到KDM2B 高表達的表觀遺傳學抑制，let-7b 的缺失上調了EZH2 的表達，從而促進了卵巢癌細胞的體內外生長。Wu 等[13]研究發現，EZH2 通過招募H3K27me3 促進miRNA-139 啟動子甲基化，從而抑制miRNA-139 的表達，而沉默EZH2則通過增加miRNA-139 的表達抑制體外腫瘤的進展；miRNA-139 靶向抑制溶血磷脂酸受體1（lysophosphatidic acid receptor 1，LPA1）和LPA1 激活的轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路是EZH2 作用于卵巢癌細胞的關鍵機制。

2.4 EZH2 與細胞代謝

EZH2 可以催化組蛋白3 上賴氨酸27 的三甲基化，從而誘導靶基因的轉錄抑制，這是EZH2 在腫瘤細胞中發揮作用的公認經典機制。然而，H3K27me3 通常在卵巢癌中表達缺失，這與EZH2作為H3K27me3 甲基轉移酶的致癌作用相矛盾。Chen 等[14]研究發現，EZH2 高表達但H3K27me3 水平低的卵巢癌患者的預后最差，異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）是三氯乙酸循環中催化α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）產生的重要酶，該研究證明EZH2 通過氧化磷酸化直接促進IDH2的轉錄，從而增強卵巢癌細胞的葡萄糖代謝。該研究發現了EZH2 促進卵巢癌發生發展的新機制，為后續卵巢癌聯合治療新策略的研發提供了重要的理論基礎。

2.5 EZH2 與細胞免疫

卵巢癌的預后與腫瘤內淋巴細胞的存在直接相關。Spiliopoulou 等[15]研究發現，同時抑制組蛋白甲基轉移酶G9A 和EZH2 的表達可以激活CXC 趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）/CXC 趨化因子受體3（C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3）信號通路，增加腫瘤內效應淋巴細胞和自然殺傷細胞的歸巢，同時抑制促瘤的叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）+CD4 T 細胞；G9A/EZH2 雙重抑制劑HKMTI-1-005可誘導染色質改變，導致免疫刺激基因網絡的轉錄激活，例如內源性逆轉錄病毒K 家族（endogenous retroviruses of the K family，ERV-K）重新表達；HKMTI-1-005 治療減輕了卵巢癌小鼠的腫瘤負荷，并提高了存活率。這些結果表明，在卵巢癌中抑制G9A 和EZH2 的表達可以改變免疫微環境，抑制腫瘤生長，這為臨床治療策略的制訂提供了新思路。

2.6 EZH2 促進鉑類耐藥

miRNA-506-3p 過表達后，多種卵巢癌細胞中EZH2mRNA 和蛋白表達均有所下降。Sun 等[16]研究表明，miRNA-506-3p 過表達可使卵巢癌細胞對PARP 抑制劑或順鉑敏感；敲低EZH2的表達后，經奧拉帕利或順鉑處理的卵巢癌細胞的增殖能力明顯下降；過表達EZH2 后，miRNA-506-3p 對奧拉帕利和順鉑敏感性的影響可以完全被逆轉；過表達EZH2 的卵巢癌細胞中β-聯蛋白（β-catenin）表達水平升高，相反，EZH2干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染降低了β-catenin 的表達；在原位卵巢癌小鼠模型中，PARP 抑制劑和順鉑對由miRNA-506-3p 介導的EZH2 和β-catenin 表達下調更具敏感性。以上結果提示，miRNA-506-3p 通過靶向EZH2/β-catenin 信號通路增強卵巢癌對PARP 抑制劑和順鉑的反應，這為miRNA-506-3p 過表達用于卵巢癌的治療開辟了新的可能性。Zhang 等[17]在耐順鉑的卵巢癌細胞株SKOV3/DDP 和A2780/DDP 中發現，HOX 轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）表達上調，而miRNA-138-5p 表達下調，HOTAIR 基因敲除可增加順鉑耐藥細胞中miRNA-138-5p 的表達，增強順鉑耐藥細胞的化療敏感性，并降低EZH2 和組蛋白去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）的表達。此外，miRNA-138-5p 抑制劑可減弱因HOTAIR 沉默誘導的順鉑耐藥細胞的化療敏感性。該研究證實了HOTAIR 可以通過抑制miRNA-138-5p 的表達，阻止其與EZH2 和SIRT1 結合，從而促進卵巢癌細胞對順鉑耐藥。

卵巢癌干細胞（ovarian cancer stem cell，OCSC）在腫瘤治療結束后的持續存在可能是耐藥腫瘤出現的原因。EZH2 在OCSC 中過表達可能有助于化療耐藥。Wen 等[18]將卵巢癌細胞系SKOV3 注射于裸鼠皮下，并定期將順鉑注入腫瘤，待腫瘤生長至一定體積時，消化獲得的腫瘤移植單細胞懸液，培養一段時間后將細胞再次注射到裸鼠體內重復傳代，直至在順鉑處理的第三代異種移植物中獲得了一株富含OCSC 的細胞系SK-3rd。利用高通量PCR 和生物信息學方法篩選與OCSC 干性相關的EZH2 靶標，發現檢查點激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是參與CSC 特性形成的EZH2 的靶基因。該研究建立了EZH2基因敲除的SK-3rd卵巢癌細胞系，EZH2基因敲除降低了CHK1 的表達，而CHK1 過表達逆轉了EZH2基因抑制腫瘤細胞球體形成和化療耐藥的作用。此外，EZH2 還與卵巢癌細胞的CHK1啟動子結合并激活CHK1 信號。在臨床試驗中，EZH2 和CHK1 水平高的卵巢癌患者對鉑類藥物更具耐藥性，預后也更差。上述研究表明，EZH2 通過激活CHK1 信號在維持OCSC 干性和化療耐藥中發揮關鍵作用。此外，Zong 等[19]研究發現，DAB2 相互作用蛋白（DAB2 interacting protein，DAB2IP）在上皮性卵巢癌細胞系中表達缺失上調了干細胞相關基因的表達，并誘導了非CSC 向CSC 轉化，而DAB2IP 表達上調則抑制了CSC 的特性。生物信息學分析和反相蛋白質陣列進一步證明，DAB2IP 通過下調重要的干性誘導因子Wnt 家族成員5B（Wnt family member 5B，WNT5B）的表達來抑制WNT 信號轉導。WNT5B 下游靶基因c-Jun可激活非規范的WNT 信號，而Rac 家族小GTP 酶1（Rac family small GTPase 1，RAC1）是c-Jun 激活的重要調節因子，通過抑制RAC1，WNT5B 通路可被阻斷。聯合應用EZH2 抑制劑GSK126 和RAC1 抑制劑NSC23766，在體外抑制了OCSC 的存活，在體內抑制了腫瘤生長并提高了其對鉑類藥物的敏感性。因此，以EZH2/DAB2IP/c-Jun 信號通路為靶點是預防卵巢癌復發的一種有前景的策略。

Xiong 等[20]對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1,6-bisphosphatase 1，FBP1）和EZH2基因序列的分析證實，FBP1和EZH2的表達在卵巢組織中呈正相關。應用FBP1 和EZH2 抗體進行的免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）實驗證實了FBP1 和EZH2 在卵巢癌細胞中相互作用。FBP1基因敲除抑制了裸鼠腫瘤的形成和卵巢癌細胞對順鉑的耐藥，并顯著降低了EZH2mRNA 和蛋白表達水平。作為EZH2 的下游靶點之一，H3K27me3蛋白表達也因FBP1基因敲除而顯著下調。qRTPCR、蛋白質印跡法（Western blot）和免疫組織化學染色結果均表明，FBP1敲低組移植瘤中EZH2 和H3K27me3 的表達強度均弱于對照組。這些結果提示，FBP1 通過上調EZH2 和H3K27me3 的表達來增加卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。

2.7 EZH2 與其他因子的相互作用

有研究指出，GEPIA 數據庫中細胞分裂周期相關蛋白7（cell division cycle associated 7，CDCA7）在卵巢癌患者卵巢癌組織和卵巢癌細胞系中的表達均升高，該現象已通過Western blot 和qRT-PCR進一步證實；將短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）CDCA7 導入SKOV3 細胞進行功能實驗，結果發現，CDCA7沉默抑制了卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并使細胞周期受阻。GeneMANIA 數據庫分析和Co-IP 實驗驗證了CDCA7 與EZH2 之間的相互作用，CDCA7 表達下調通過抑制EZH2的表達抑制血管生成，這為卵巢癌的治療開發了一個有前景的分子靶點[21]。此外，Wang 等[22]發現染色質域解旋酶DNA 結合蛋白4（chromodomain helicase DNA binding protein 4，CHD4）在卵巢癌細胞轉移過程中發揮重要作用。在卵巢癌組織中，CHD4 高表達與患者的預后不良有關。CHD4 在卵巢癌細胞中的功能喪失可抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和Western blot探索CHD4的調控機制，發現CHD4基因敲除抑制了EZH2 的表達和βcatenin的核積聚，還抑制了卵巢癌細胞的轉移，并阻止了小鼠模型的疾病進展。另有研究證明，EZH2可以通過N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）參與卵巢癌的抗失巢過程，從而促進卵巢腺癌腹腔轉移，EZH2在卵巢癌大網膜轉移組織中的表達水平明顯高于正常卵巢組織[23]。抗失巢的形成被認為是原發惡性腫瘤轉移過程中的關鍵步驟。該研究建立了卵巢癌細胞失巢模型和裸鼠異種移植瘤模型，發現降低EZH2的表達水平可在體外抑制m6A的表達并抑制卵巢癌細胞的抗失巢，還可在體內抑制卵巢癌進展。黃芩素是從多年生草本植物黃芩中發現的一種黃酮類化合物，在多種人類惡性腫瘤中具有抗腫瘤活性。Lang等[24]研究探討了黃芩素對卵巢癌的影響發現，其抑制了卵巢癌細胞A2780和SKOV3的存活、遷移和侵襲，并減少了EZH2在卵巢癌細胞中的表達。此外，叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）在卵巢癌組織和細胞中表達下調，并受EZH2的負調控。同時，黃芩素還能抑制體內腫瘤的生長和轉移。該研究還發現，黃芩素可以通過調節EZH2/FOXO1 信號通路抑制卵巢癌的發生發展。Han等[25]研究發現，在高級別漿液性卵巢癌中，特異性的細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）抑制劑抑制了EZH2在T416位點的磷酸化，進而激活其下游靶基因雌激素受體（estrogen receptor，ER）α的表達。因此CDK2 抑制劑和他莫昔芬聯合應用可發揮顯著的協同抗腫瘤作用。

3 EZH2 抑制劑用于卵巢癌的治療

3.1 EZH2 抑制劑與PARP 抑制劑

雖然EZH2 和PARP 分別具有不同的作用機制和功能，但EZH2 和PARP 在DNA 損傷、細胞周期等方面具有一些共同特征[26]。因此，PARP 抑制劑和EZH2 抑制劑可能具有協同或拮抗作用。Karakashev 等[27]研究表明，EZH2 抑制劑可上調有絲分裂阻滯缺陷2 樣蛋白2（mitotic arrest deficient 2 like 2，MAD2L2）的表達，并以共激活相關精氨酸甲基轉移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，CARM1）依賴的方式使無同源重組缺陷（homologous recombination-proficient，HRp）的上皮性卵巢癌對PARP 抑制劑敏感。CARM1 通過甲基化MAD2L2啟動子上交配型轉換（mating type switching，SWI）/蔗糖不發酵（sucrose non-fermenting，SNF）復合體的BAF155 亞基，推動亞基從SWI/SNF 復合體到EZH2 的轉換，從而促進MAD2L2沉默。EZH2 抑制劑通過上調MAD2L2 的表達減少DNA 末端切除，從而增加非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和染色體異常，最終導致HRp 的細胞在PARP 抑制劑處理后發生有絲分裂災變。以上研究證明EZH2 抑制劑使CARM1高表達并使HRp 的卵巢癌細胞對PARP 抑制劑敏感，其中值得一提的是EZH2 與PARP 在腫瘤免疫微環境中具有相關性。Pantelidou 等[28]對體外乳腺癌細胞的分析結果表明，PARP 抑制劑激活了環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）/干擾素反應刺激因子cGAMP 相互作用因子1（stimulator of interferon response cGAMP interactor 1，STING）通路，體內實驗進一步表明PARP抑制劑可誘導STING/TANK 結合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）/干擾素調節因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）通路激活，從而幫助樹突細胞識別腫瘤抗原，進一步募集和激活CD8+T 細胞，而EZH2 抑制劑也被證明能夠促進STING 通路介導的T 細胞滲透和抗腫瘤作用[29-30]。以上結果表明，EZH2 抑制劑和PARP 抑制劑可能在調節腫瘤免疫微環境的過程中發揮協同作用。但Yang 等[31]研究發現，PARP抑制劑聯合EZH2抑制劑可促進小鼠體內腫瘤相關巨噬細胞向具有促腫瘤作用的M2型巨噬細胞分化，并促進腫瘤新生血管生成。說明EZH2 抑制劑聯合PARP 抑制劑會對腫瘤微環境中的免疫細胞產生負面影響。一方面，EZH2 抑制劑可以促進免疫細胞在腫瘤微環境中的滲透，從而增強PARP 抑制劑的抗腫瘤效果。另一方面，這兩種藥物的聯合會擾亂腫瘤的免疫微環境。因此，在卵巢癌中，這兩種藥物的聯合應用亟待進一步研究。

3.2 EZH2 抑制劑的研發

目前一些小分子EZH2 抑制劑DZNep、SHR2554、CPI-169、CPI-1205、他澤司他（Tazemetostat）、伐美妥司他（Valemetostat）和GSK2816126 等在淋巴瘤、骨髓瘤、惡性胸膜間皮瘤、上皮細胞肉瘤、前列腺癌等腫瘤治療中已進入臨床試驗階段。DZNep 是一種S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAH）抑制劑，能夠通過增加SAH 的表達間接抑制EZH2 的表達，從而抑制依賴于腺苷-L-蛋氨酸的組蛋白甲基轉移酶的活性[32]。與SAM 競爭的EZH2 抑制劑如CPI-1205 和GSK2816126 目前正在淋巴瘤、多發性骨髓瘤、前列腺癌等腫瘤中進行臨床試驗。GSK2816126 對野生型和Y641 突變型EZH2具有相似的抑制效力[33]。此外，他澤司他因其出色的藥效和藥代動力學特性已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于治療上皮樣肉瘤和濾泡性淋巴瘤[34]。目前臨床上尚無可用于治療卵巢癌的EZH2 抑制劑，在卵巢癌中EZH2 抑制劑還處于臨床前實驗階段。新型EZH2抑制劑SKLB-03220 對突變型EZH2顯示出良好的抑制活性，能夠通過抑制H3K27me3 對卵巢癌細胞表現出明顯的抗腫瘤作用[35]。此外，口服SKLB-0322 可以明顯抑制異種移植瘤模型中腫瘤生長。可見EZH2 抑制劑是針對卵巢癌十分具有潛力的治療藥物，具有良好的應用前景。

4 小結與展望

綜上所述，在卵巢癌中，EZH2 通常過表達，因此可能成為卵巢癌的治療靶點。目前針對EZH2的多種小分子抑制劑正在陸續開發。已研發的EZH2 抑制劑在動物實驗中的療效已得到了證實，但是在臨床試驗中的作用有待進一步研究。靶向EZH2 或與其他治療方法聯合，是一種具有潛力的卵巢癌治療新策略。