高效脫氮降磷菌株的篩選及在工廠化鰻鱺養(yǎng)殖中的應(yīng)用

朱振興,江興龍,劉 勇

(1 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門 361021;2 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心,福建 廈門 361021)

近年來,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)用水的獲取越來越困難,已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要制約因素之一[1-4]。水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中含有大量由氮磷元素組成的化合物,這些高濃度的氮磷成分可導(dǎo)致水體的富營(yíng)養(yǎng)化[5-6]。未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排入自然水域會(huì)惡化流域內(nèi)的生態(tài)環(huán)境,影響水生動(dòng)植物的生長(zhǎng)[7]。解決水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的氮磷降解問題對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[8-9]。

好氧反硝化聚磷菌(Aerobic denitrifying phosphorus removing bacteria)是一種新興的復(fù)合型氮磷降解功能菌群,在污廢水的處理過程中可對(duì)氮磷污染物實(shí)現(xiàn)同步處理,可以在真正意義上實(shí)現(xiàn)“一碳兩用”的作用效果,并大幅提高碳源利用效率[10]。Zhang等[11]以海水養(yǎng)殖池塘的廢水為底物,篩選得到一株耐鹽聚磷菌BacillussubtilisGHSP10,可有效去除海水養(yǎng)殖污水中的氮和磷。Hou等[12]從養(yǎng)殖水域沉積物中分離得到一株具有氮磷同步降解能力的新型聚磷菌PseudomonaschloritidismutansK14,在最佳條件下,可降解好氧反硝化除磷培養(yǎng)基中99.78%的硝酸鹽和超過98%的磷。盡管已有的研究結(jié)果表明好氧反硝化聚磷菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有良好的效果,但多數(shù)的研究主要是使用針對(duì)人工配制的半合成/合成液體培養(yǎng)基進(jìn)行氮磷降解試驗(yàn)而獲得的數(shù)據(jù)。

本研究通過對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖尾水處理池中采集的淤泥進(jìn)行分離篩選,獲得一株高效好氧反硝化聚磷菌,進(jìn)行了菌種鑒定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定,并研究其對(duì)工廠化鰻鱺精養(yǎng)殖水體中氮磷的降解效果和應(yīng)用安全性。

1 材料與方法

1.1 好氧反硝化聚磷菌的分離篩選與鑒定

通過MOPS-Glu過磷/限磷篩選試驗(yàn)[13-14]和好氧反硝化聚磷菌的定向馴化,本研究從福建南平鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)尾水處理池中篩選得到一株高效好氧反硝化聚磷菌。使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取菌株的基因組DNA,以16S rDNA序列的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')為PCR反應(yīng)引物,使用2 ×TsingKE Master Mix 體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 1 μL,2 ×TsingKE Master Mix 25 μL,27F Primer(10 μM)1 μL,1492R Primer(10 μM)1 μL,dH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃ 10 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min),延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以確定功能菌株的種屬信息。

1.2 功能菌株的生長(zhǎng)曲線

制備功能菌株的種子液,以無菌 LB液體培養(yǎng)基為本底,加入種子液200 μL,在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)41 h,并測(cè)量特定培養(yǎng)時(shí)刻的OD600。以O(shè)D600為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制功能菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3 功能菌株氮磷降解最優(yōu)條件試驗(yàn)

通過單因素控制變量法,研究功能菌株的氮磷降解最優(yōu)條件。在碳源種類試驗(yàn)中,葡萄糖、紅糖(食品級(jí))和淀粉(食品級(jí))分別作為唯一的碳源。在碳氮比試驗(yàn)中,通過改變碳源添加量,將碳氮比調(diào)整為 2、4、6、8、10、12。在接種量試驗(yàn)中,通過改變功能菌株種子液的添加量,將接種量調(diào)節(jié)為0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%。各試驗(yàn)組經(jīng)對(duì)應(yīng)方法處理后,使用棉花封住瓶口,在30 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后進(jìn)行采樣,經(jīng)高速離心后,測(cè)量離心后的上清液中總磷和硝酸鹽氮的殘余量,計(jì)算降解率,確定功能菌株氮磷降解最優(yōu)條件。

1.4 功能菌株對(duì)鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)的氮磷降解效果

本底溶液采用集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng)鰻鱺工廠化養(yǎng)殖車間養(yǎng)殖水質(zhì)。本試驗(yàn)的處理組分補(bǔ)充碳源組和無補(bǔ)充碳源組,補(bǔ)充碳源組通過添加無水葡萄糖調(diào)節(jié)碳氮比至7.9,無補(bǔ)充碳源組不添加任何成分(碳氮比為0.55),擴(kuò)增培養(yǎng)的功能菌株種子液均以0.5%的接種量一次性接種于1 L的本底溶液中;對(duì)照組不添加菌液和碳源。在30 ℃、180 r/min條件下,恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)。除測(cè)定養(yǎng)殖水質(zhì)本底的總磷和硝酸鹽質(zhì)量濃度外,于水力停留時(shí)間在12 h、24 h和48 h立即采集各組樣品,30 ℃、10 000 r/min、離心10 min(離心半徑9.35 cm),測(cè)量離心后的上清液中總磷和硝酸鹽氮的殘余量,計(jì)算降解率。

1.5 功能菌株在美洲鰻鱺工廠化養(yǎng)殖中的應(yīng)用

應(yīng)用于工廠化鰻鱺精養(yǎng)殖,以8×107cfu/L的接種量至含0.8 m3水體的養(yǎng)殖美洲鰻鱺(Anguillarostrata)的塑料桶中,對(duì)照組不添加功能菌株菌液,設(shè)雙平行對(duì)照試驗(yàn);處理組和對(duì)照組的美洲鰻鱺養(yǎng)殖密度25 kg/m3,平均規(guī)格250 g/尾。試驗(yàn)期間,于水力停留時(shí)間在0 h、12 h和24 h分別采集各桶養(yǎng)殖水樣,測(cè)定總磷、硝酸鹽氮質(zhì)量濃度,計(jì)算降解率。按1.5%投料率投喂飼料,飼料采用福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的鰻魚黑仔配合飼料,養(yǎng)殖持續(xù)30 d,并觀察美洲鰻鱺的生長(zhǎng)情況。

1.6 水質(zhì)檢測(cè)方法

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)組(對(duì)照組)進(jìn)行3次相同的生物學(xué)重復(fù),儀器測(cè)量讀數(shù)進(jìn)行3次。計(jì)算公式如下:

(1)

式中:η為氮磷降解率(%);C1為初始質(zhì)量濃度(mg/L);C2為最終質(zhì)量濃度(mg/L)。

(2)

式中:RC/N為碳氮比;CTC為碳源質(zhì)量濃度(以高錳酸鹽指數(shù)CODmn計(jì)算,mg/L);CTN為氮源質(zhì)量濃度(以總氮TN計(jì)算,mg/L)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行,并以P<0.05表示差異顯著。統(tǒng)計(jì)圖均采用Origin 2022軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 好氧反硝化聚磷菌的鑒定

BLAST同源序列比對(duì)結(jié)果顯示,本研究篩選得到的功能菌株與Acinetobactertandoiistrain 2pw_2(GenBank登錄號(hào):LC191526.1)相似性高達(dá)100%。采用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(Neighbor-Joining法)如圖1所示,結(jié)果顯示菌株P(guān)P-1與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的4株Acinetobactertandoii16S rDNA序列處于進(jìn)化樹的同一分支且距離最近。將菌株P(guān)P-1的16S rDNA序列上傳到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ezbiocloud.net/)如圖2所示,結(jié)果顯示菌株P(guān)P-1與16S rRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的Acinetobactertandoiistrain DSM 14970(Accession:KE007359)相似性高達(dá)99.93%。結(jié)合上述鑒定分析結(jié)果,判斷菌株P(guān)P-1為坦氏不動(dòng)桿菌(Acinetobactertandoii),并將其命名為坦氏不動(dòng)桿菌 PP-1。

圖1 菌株P(guān)P-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain PP-1

2.2 菌株P(guān)P-1的生長(zhǎng)曲線

菌株P(guān)P-1的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 菌株P(guān)P-1的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of strain PP-1

在0～2.5 h內(nèi)處于生長(zhǎng)遲緩期,生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)2.5 h后,曲線以對(duì)數(shù)形式增長(zhǎng),生長(zhǎng)迅速。17.5 h后細(xì)胞生長(zhǎng)率逐步下降,并開始進(jìn)入穩(wěn)定期,在25 h達(dá)到生長(zhǎng)曲線峰值,菌體總數(shù)趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)29 h后,開始進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株P(guān)P-1的氮磷降解最優(yōu)條件

菌株P(guān)P-1的氮磷降解最優(yōu)條件見表1。根據(jù)測(cè)定結(jié)果可知,當(dāng)選取葡萄糖作為碳源時(shí),菌株P(guān)P-1對(duì)總磷和硝酸鹽氮的降解率均在60%以上;當(dāng)碳氮比為8時(shí),菌株P(guān)P-1對(duì)總磷和硝酸鹽氮的降解率最高,分別可達(dá)76.24%和83.97%;當(dāng)接種量為0.5%和0.8%時(shí),菌株P(guān)P-1對(duì)總磷和硝酸鹽氮的降解率也均在60%以上。在接種量最優(yōu)條件選取方面,雖然菌株P(guān)P-1對(duì)總磷和硝酸鹽氮的降解效果以接種量為0.8%時(shí)最優(yōu),但其降解率與接種量為0.5%時(shí)的降解率相差不大。

因此,綜合考慮各單因素試驗(yàn)結(jié)果和應(yīng)用成本,菌株P(guān)P-1的最佳應(yīng)用條件為葡萄糖、碳氮比8和接種量0.5%。

2.4 菌株P(guān)P-1對(duì)鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)中總磷和硝酸鹽氮的降解效果

菌株P(guān)P-1對(duì)鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)中總磷和硝酸鹽氮的降解效果測(cè)定結(jié)果見表2、表3。據(jù)測(cè)定結(jié)果可知,在添加補(bǔ)充碳源的條件下,菌株P(guān)P-1在水力停留時(shí)間為12 h、24 h時(shí)對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖水質(zhì)中的總磷降解率可分別達(dá)到56.31%和81.82%;在水力停留時(shí)間為12 h、24 h時(shí)對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖水質(zhì)中的硝酸鹽氮降解率可分別達(dá)到65.5%和90.37%。另一方面,補(bǔ)充碳源組在水力停留時(shí)間為24 h時(shí)可使總磷質(zhì)量濃度從5.008 mg/L降至0.911 mg/L,補(bǔ)充碳源組的總磷降解率均顯著高于無補(bǔ)充碳源組44.8%和對(duì)照組75.6%(P<0.05);補(bǔ)充碳源組在水力停留時(shí)間為24 h時(shí)可使硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從14.362 mg/L降至1.383 mg/L,硝酸鹽氮降解率均顯著高于無補(bǔ)充碳源組57.3%和對(duì)照組78.9%(P<0.05)。

表2 菌株P(guān)P-1對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖水質(zhì)中的總磷降解效果測(cè)定Tab.2 Determination of total phosphorus degradation effect by strain PP-1 on water quality of Anguilla rostrata culture

表3 菌株P(guān)P-1對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖水質(zhì)中的硝酸鹽氮降解效果測(cè)定Tab.3 Determination of nitrate nitrogen degradation effect by strain PP-1 on water quality of Anguilla rostrata culture

2.5 工廠化養(yǎng)殖應(yīng)用效果

菌株P(guān)P-1應(yīng)用于工廠化養(yǎng)殖,美洲鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)因子濃度變化情況對(duì)比如表4所示。結(jié)果表明,當(dāng)水力停留時(shí)間在12 h時(shí),添加菌液的處理組鰻鱺養(yǎng)殖水體中的總磷質(zhì)量濃度從4.97 mg/L降至3.08 mg/L(降解率38%),硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從6.27 mg/L降至4.05 mg/L(降解率35.4%);當(dāng)水力停留時(shí)間在24 h時(shí),添加菌液的處理組鰻鱺養(yǎng)殖水體中的總磷質(zhì)量濃度從4.97 mg/L降至2.05 mg/L(降解率58.8%),硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從6.27 mg/L降至2.75 mg/L(降解率56.1%),均具有顯著差異(P<0.05)。美洲鰻鱺養(yǎng)殖期間,處理組的總磷和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。美洲鰻鱺工廠化養(yǎng)殖情況如表5所示。試驗(yàn)期間,美洲鰻鱺健康生長(zhǎng)。處理組總質(zhì)量增加8.2 kg,存活率達(dá)99.82%,無發(fā)病和異常死亡。表明菌株P(guān)P-1應(yīng)用于工廠化美洲鰻鱺養(yǎng)殖是安全的。

表5 美洲鰻鱺生長(zhǎng)情況Tab.5 The conditions ofAnguilla rostrata culture and production

圖4 美洲鰻鱺養(yǎng)殖水質(zhì)因子濃度動(dòng)態(tài)變化情況Fig.4 Dynamic changes in the concentration of water quality factors inAnguilla rostrata culture

3 討論

3.1 菌株P(guān)P-1的最佳培養(yǎng)時(shí)間與菌種制備條件

微生物典型生長(zhǎng)曲線(Growth curve)對(duì)于有效利用和確定微生物的最佳培養(yǎng)時(shí)間具有重要參考意義[18]。Li等[19]分離篩選得到一株可降解菲類多環(huán)芳烴污染物的坦氏不動(dòng)桿菌(A.tandoii)LJ-5,研究發(fā)現(xiàn)菌株LJ-5在培養(yǎng)24～26 h時(shí),生長(zhǎng)量達(dá)到最大值。而Wang等[20]對(duì)坦氏不動(dòng)桿菌(A.tandoii)ZM06生長(zhǎng)情況的研究也發(fā)現(xiàn),菌株ZM06在最佳條件下的單一培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線峰值出現(xiàn)于24 h左右。在本研究中,菌株P(guān)P-1的生長(zhǎng)曲線峰值處于25 h左右,說明其在30 ℃時(shí)的最佳培養(yǎng)時(shí)間為25±1 h,這與上述研究結(jié)果基本吻合。因此,在制備菌株P(guān)P-1種子液時(shí),應(yīng)注意培養(yǎng)時(shí)間的選取,并及時(shí)保存培養(yǎng)物以保證擴(kuò)培效果。

3.2 鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)改良效果

利用脫氮降磷功能菌株對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)進(jìn)行降解修復(fù)已逐步成為當(dāng)前微生物氮磷降解研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[21]。該方法不僅能夠?qū)λw環(huán)境進(jìn)行氮磷降解,還可提高水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的免疫力[22]。Wang等[23]在測(cè)試氮磷降解功能微生物對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖的有效性研究中發(fā)現(xiàn),氮磷降解功能微生物可顯著降低池塘水體中的氮磷含量(P<0.05),實(shí)現(xiàn)南美白對(duì)蝦的增產(chǎn)。陳翠雪[24]等采用直接潑灑復(fù)合微生物菌劑的方式進(jìn)行海水魚養(yǎng)殖的原位修復(fù)工作,試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水體的CODcr、 BOD5、總氮和總磷分別降低61.2%、53.3%、38.1%和27.4%。在本研究中,菌株P(guān)P-1在24 h內(nèi)對(duì)鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)中總磷和硝酸鹽氮的降解率可分別達(dá)到81.82%和90.37%,在相同時(shí)間內(nèi)的氮磷降解率普遍高于現(xiàn)有研究水平[11,12],具備短時(shí)間(24 h)內(nèi)快速降解工廠化養(yǎng)殖水體中總磷和硝酸鹽氮的能力,可實(shí)現(xiàn)高效快速降低工廠化養(yǎng)殖水體中的氮磷質(zhì)量濃度。在美洲鰻鱺工廠化養(yǎng)殖期間,美洲鰻鱺健康生長(zhǎng)、無病和大規(guī)模死亡,這說明菌株P(guān)P-1在鰻鱺工廠化養(yǎng)殖水體中能有效降低總磷和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度,穩(wěn)定水質(zhì)且具有良好的養(yǎng)殖安全性。

3.3 補(bǔ)充碳源對(duì)菌株P(guān)P-1氮磷降解性能的影響

補(bǔ)充碳源是影響好氧反硝化聚磷菌生長(zhǎng)和反硝化聚磷作用過程的關(guān)鍵因素之一[25]。以乙酸鈉等為代表的小分子類碳源已逐漸成為好氧反硝化聚磷菌應(yīng)用研究中常見的碳源種類[26-28],這主要得益于微生物的分解代謝作用與碳源的化學(xué)結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)。相比于其他碳源,小分子類碳源具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量,所以在碳源的分解代謝過程中更容易被微生物所利用[29]。然而,由于小分子類碳源普遍存在使用成本過高[30-32]等缺點(diǎn),很難大規(guī)模應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的氮磷降解過程中。與小分子類碳源相比,盡管葡萄糖存在反應(yīng)速率低等問題,但仍有研究報(bào)道了葡萄糖作為好氧反硝化聚磷菌碳源的潛力。吳守中[33]在探究不同碳源對(duì)反硝化聚磷菌C18氮磷降解特性影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)葡萄糖作為補(bǔ)充碳源時(shí),菌株C18的氮磷降解效果與乙酸鈉作為碳源時(shí)的差別不大。在本研究中,補(bǔ)充碳源組的24 h氮磷降解率均顯著高于無補(bǔ)充碳源組(P<0.05),說明以葡萄糖作為補(bǔ)充碳源可顯著促進(jìn)菌株P(guān)P-1降解總磷和硝酸鹽氮,也間接證明了菌株P(guān)P-1屬于異養(yǎng)型細(xì)菌。

4 結(jié)論

通過對(duì)坦氏不動(dòng)桿菌(A.tandoii)PP-1的氮磷降解性能及其在鰻鱺工廠化養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,當(dāng)水力停留時(shí)間為24 h時(shí),坦氏不動(dòng)桿菌PP-1的總磷和硝酸鹽氮降解率可分別達(dá)到81.82%和90.37%,坦氏不動(dòng)桿菌PP-1具備短時(shí)間(24 h)內(nèi)快速降解工廠化養(yǎng)殖水體中總磷和硝酸鹽氮的能力;此外,以葡萄糖作為補(bǔ)充碳源可顯著提高坦氏不動(dòng)桿菌PP-1的降解總磷和硝酸鹽氮效果,24 h降解率分別顯著提高44.8%和57.3%。坦氏不動(dòng)桿菌PP-1可在短時(shí)間內(nèi)降解養(yǎng)殖水體中的總磷和硝酸鹽。