溶解碳源與固體碳源對對蝦生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的影響

王瑞龍,陳 釗,李 健

(1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071;2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

中國是世界主要的養(yǎng)蝦大國,截至2019年,凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的養(yǎng)殖產(chǎn)量超過中國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的85%[1]。在凡納濱對蝦養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量逐年增加的同時(shí)也會(huì)伴隨著很多養(yǎng)殖問題,水質(zhì)惡化是最嚴(yán)重的問題之一,由于養(yǎng)殖者追求利益最大化,在對蝦高密度、集約化養(yǎng)殖過程中,大量的飼料和對蝦代謝物的沉積,會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水體內(nèi)源性污染嚴(yán)重,養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化等一系列問題。開展對蝦節(jié)水減排型養(yǎng)殖技術(shù)研究是中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的重要發(fā)展方向。

(5) 基于既有經(jīng)驗(yàn)與研究，通常選取地形地貌、地質(zhì)構(gòu)造、工程巖組、水系、降雨、植被覆蓋、人類活動(dòng)7個(gè)方面作為評(píng)價(jià)因子。這樣可以高效利用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，且可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)較為準(zhǔn)確地賦值。但今后還可進(jìn)一步思考完善，提出更優(yōu)的評(píng)價(jià)因子組合以及賦值標(biāo)準(zhǔn)。

生物絮團(tuán)技術(shù)的研究發(fā)展為對蝦節(jié)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的全面實(shí)踐應(yīng)用提供了技術(shù)支撐和解決途徑[2],生物絮團(tuán)技術(shù)是通過人為添加有機(jī)碳源,調(diào)節(jié)水體中異養(yǎng)菌的數(shù)量,通過異養(yǎng)菌對氨氮等養(yǎng)殖代謝產(chǎn)物的吸收同化,從而達(dá)到水體凈化的過程,同時(shí)由微生物絮凝形成的顆粒物質(zhì)也能被養(yǎng)殖生物所攝食,促進(jìn)營養(yǎng)循環(huán),提高養(yǎng)殖生物的存活率[3]。通過將生物絮團(tuán)投入到現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn),對養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮水平有著顯著降低作用[4]。

生物絮團(tuán)的有機(jī)碳物質(zhì)添加種類比較豐富,總的大類可以分為簡單溶解碳源以及復(fù)合固體碳源。簡單溶解性碳源包括葡萄糖[5]、紅糖[6]、糖蜜[7]等,其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)應(yīng)答快,但是需要在養(yǎng)殖過程中不斷添加,使用成本較高;復(fù)合固體碳源一般為分子量較大的物質(zhì),如木薯渣[8]、馬鈴薯渣[9]、甘蔗渣[10]等,這一類碳源在微生物作用下被分解為小分子物質(zhì),緩慢釋放碳源,其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定持久,同時(shí)可以作為載體為硝化細(xì)菌等提供充足的附著生長空間,但是反應(yīng)應(yīng)答慢,需要的時(shí)間長。碳源的種類不僅影響生物絮團(tuán)培養(yǎng)的時(shí)間,還會(huì)影響生物絮團(tuán)的組成結(jié)構(gòu),添加碳源的種類在很大程度上決定著生物絮團(tuán)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[11-12]。王潮輝[5]在生物絮團(tuán)系統(tǒng)中添加葡萄糖可以加快異養(yǎng)細(xì)菌的增殖,更快地同化吸收水體中的氨氮及亞硝酸鹽氮,維持水體穩(wěn)定,但是葡萄糖成本過高,實(shí)際養(yǎng)殖效果并不理想;尚謙[8]向水體中添加木薯渣不僅提高了生物絮團(tuán)系統(tǒng)內(nèi)部益生菌和異養(yǎng)細(xì)菌的豐度水平以及對蝦的生長性能,同時(shí)解決了農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用問題,但是木薯渣在水質(zhì)調(diào)控方面效果要比蔗糖培養(yǎng)絮團(tuán)效果差。溶解性碳源與固體性碳源在生物絮團(tuán)培養(yǎng)中各有利弊,溶解性碳源與固體性碳源混合添加可以聯(lián)合二者的優(yōu)勢、彌補(bǔ)單獨(dú)使用時(shí)的不足,目前此方面的研究報(bào)道較少。

她說，我夢見依舊睡在她臥房旁邊。凌晨時(shí)分，工作間里響起織布的聲音，間歇持續(xù)，是從小熟悉的聲音。醒不過來，心里想著她已回來，不禁內(nèi)心釋然。我期待她帶我上路。期待她從背后拿出一束石竹花。她離去后，我便不知道可以跟隨誰。我愛她。在愛她的同時(shí)，又輕視她。我站在岸邊旁觀她如何墮落于海水之中，我看到她死去。

試驗(yàn)在18個(gè)150 L聚乙烯塑料水桶內(nèi)進(jìn)行,水桶內(nèi)注入100 L海水,每個(gè)水桶內(nèi)安置2個(gè)氣石用于充分增氧和攪動(dòng)水體。每個(gè)桶內(nèi)均勻地放入40尾體色正常,健康有活力的幼蝦,并做好記錄。飼料投喂時(shí)間為每天的06:00、10:00、14:00、18:00、22:00。投飼率按照對蝦體質(zhì)量百分?jǐn)?shù)遞減,從試驗(yàn)開始時(shí)的5%逐漸減至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的3%,養(yǎng)殖過程中依據(jù)攝食情況進(jìn)行階段性調(diào)節(jié),對照組每天換水50%,處理組每隔2 d換水30%,所有養(yǎng)殖水桶投喂等量飼料,試驗(yàn)周期為40 d,每日對換水以及喂料作好記錄。5個(gè)處理組分別以花生殼粉與紅糖的搭配比例作為處理,碳源總添加量為日投喂量的70%,將花生殼粉與紅糖的添加比例設(shè)置5個(gè)不同比例梯度(表1)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用凡納濱對蝦蝦苗,幼蝦體色正常,健康活潑。試驗(yàn)在青島瑞滋集團(tuán)有限公司海洋水產(chǎn)種業(yè)創(chuàng)新中心進(jìn)行,養(yǎng)殖用水取自近岸海水,海水經(jīng)二次殺菌消毒后投入使用。海水鹽度為(32.0±0.4)‰, pH為7.9±0.3,溫度為(26.0±0.4) ℃,水體持續(xù)充氣。對蝦配合飼料粗蛋白含量為42%,花生殼粉購自江蘇省連云港市聯(lián)邦農(nóng)產(chǎn)品深加工工廠,花生殼粉粒徑≤0.074 mm(過200目篩網(wǎng));紅糖購自山東金百倉糖業(yè)有限公司,含糖量為98%。

1.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備與設(shè)計(jì)

本研究將紅糖與花生殼粉按照不同比例添加,探究不同碳源添加比例下水體水質(zhì)變化、養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)以及對蝦生長表現(xiàn),構(gòu)建經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、高效的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng),為對蝦的綠色養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

表1 不同碳源的添加比例及試驗(yàn)處理組簡稱Tab.1 Addition proportion of different carbon sources and abbreviation of experimental treatment group

1.3 日常水質(zhì)監(jiān)測

每2 d用水質(zhì)檢測儀(In-Situ,AquaTROLL 400)測定各試驗(yàn)水桶的水溫、鹽度以及溶氧。生物絮團(tuán)處理組水體若pH低于7.5,通過添加適量碳酸氫鈉溶液緩慢調(diào)節(jié)至7.8。

1.4 生物絮團(tuán)微生物樣品測定

1949年2月9日，翦伯贊在金毓黻長子金長佑的陪同下來探訪金毓黻，翦伯贊談到“中共方面極注重研究歷史”，委托金毓黻幫助聯(lián)絡(luò)在北平的史家同行進(jìn)行座談。金毓黻是日日記中記載：“翦君著《中國通史》已成首次兩冊，系用唯物史觀立論。往在重慶，佑兒首為印行，銷路頗佳，因此余亦得識(shí)翦君。”[1](第9冊，P6767)[注]①1949年2月9日翦伯贊來訪，見“翦君來訪系今日事，誤記于昨日(2月8日)”(第9冊，第6768頁)。 翦伯贊《中國通史》是金長佑主持的五十年代出版社承擔(dān)印刷的，因而金毓黻、翦伯贊二人得以相識(shí)，由此得以近距離接觸馬克思主義史家。

YSGR=100%×(lnm1-lnm2)/t

冰凍組織樣品取出后,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶ 9的比例,加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(生理鹽水),冰水浴條件下機(jī)械勻漿,經(jīng)低速離心(2 500 r/min,4 ℃,4 000×g)后,取上清液再用生理鹽水按照1∶ 9稀釋成1%組織勻漿用于谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶活力測定。

Miseq文庫構(gòu)建及Miseq測序:通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端;使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物;Tris-HCl緩沖液洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測;氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。檢測合格文庫后,采用Miseq進(jìn)行測序。

數(shù)據(jù)分析處理:采用Mothur軟件將得到的 16S rDNA基因序列在RDP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn),充分去除嵌合體序列。為了得到每個(gè)運(yùn)算分類單元(OTU)對應(yīng)的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的運(yùn)算分類單元代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,用Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線[16]。

1.5 對蝦酶活分析

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),收獲每個(gè)試驗(yàn)桶內(nèi)對蝦,并進(jìn)行稱重、計(jì)數(shù)。在每個(gè)試驗(yàn)桶內(nèi)隨機(jī)選取8尾對蝦,取出完整的肝胰腺,裝入離心管中后迅速浸入液氮罐中保存,然后帶回試驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

這需要單位把長期投資方案的現(xiàn)金進(jìn)行流出，然后把相關(guān)建設(shè)投資各年所獲得的現(xiàn)金流入，該方法主要是利用相同時(shí)點(diǎn)的數(shù)值來進(jìn)行表示，最后則需要進(jìn)行對比分析。對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析的目的是為了能夠了解到方案的經(jīng)濟(jì)性，從而把各方案的投資利益都?xì)w納到客觀的基礎(chǔ)上。

1.6 對蝦生長性能測定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),將每個(gè)桶內(nèi)收獲記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,包括存活率(SR,%)以及特定生長率(SGR,d/%)。計(jì)算公式如下:

XSR=100%×(n1/n2)

二是評(píng)價(jià)內(nèi)容全面。評(píng)價(jià)內(nèi)容除了納稅主體對稅務(wù)工作人員的服務(wù)滿意度以外，還應(yīng)當(dāng)加入其他能夠覆蓋稅務(wù)辦理業(yè)務(wù)各個(gè)環(huán)節(jié)、涉及稅務(wù)業(yè)務(wù)辦理的各個(gè)工作人員的評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而使得評(píng)價(jià)體系更為全面。

(1)

DNA抽提與PCR擴(kuò)增:環(huán)境樣品進(jìn)行DNA抽提,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA,檢測結(jié)束后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,按照指定測定區(qū)域,合成帶有barcode的特異引物(為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性,需滿足兩個(gè)條件:盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增;保證每個(gè)樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致。隨機(jī)選取具有代表性的樣本進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣本能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物。)

由于核心網(wǎng)網(wǎng)元之間的接口所涉及的鏈路，均通過核心網(wǎng)CE進(jìn)行互聯(lián)，對移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)的鏈路只需采集核心網(wǎng)CE與各個(gè)網(wǎng)元之間的鏈路，集采系統(tǒng)建議設(shè)置在核心網(wǎng)CE側(cè)，如下圖：

(2)

式中:XSR為存活率,%;YSGR為特定生長率,%/d;n1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對蝦存活尾數(shù);n2為試驗(yàn)開始時(shí)投放的對蝦尾數(shù);m1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對蝦平均體質(zhì)量,g;m2為試驗(yàn)開始時(shí)對蝦平均體質(zhì)量,g;t為養(yǎng)殖時(shí)間,d。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),對每個(gè)生物絮團(tuán)內(nèi)水體進(jìn)行抽濾,獲得生物絮團(tuán)樣品,將濾膜置于-20 ℃保存,以備后續(xù)高通量測序分析,監(jiān)測不同絮團(tuán)處理組系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落變化以及優(yōu)勢菌群。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,用GraphPad 8.0進(jìn)行圖表數(shù)據(jù)處理,文中的數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示,通過單因素ANOVA和多重比較處理所得數(shù)據(jù),以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物絮團(tuán)養(yǎng)殖周期內(nèi)的水體無機(jī)氮指標(biāo)變化

圖2為各個(gè)處理組及對照組在試驗(yàn)周期內(nèi)亞硝酸鹽氮水平變化。各個(gè)處理組在試驗(yàn)開始兩周內(nèi)亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化很小,在第13～25天,亞硝酸鹽氮開始持續(xù)升高。在第25天,C_2_1組亞硝酸鹽氮達(dá)到整個(gè)試驗(yàn)周期峰值(2.77±0.08 mg/L),25 d至試驗(yàn)結(jié)束,該組亞硝酸鹽氮持續(xù)下降;對照組在開始1個(gè)月內(nèi)亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度維持在1 mg/L以下,1個(gè)月后濃度持續(xù)上升;紅糖組在試驗(yàn)周期內(nèi)大體呈上升趨勢;花生殼粉組在試驗(yàn)初期亞硝酸鹽氮去除效果相較于紅糖組差,但是到試驗(yàn)后期亞硝酸鹽氮降低到了較低濃度水平;混合碳源處理組中亞硝酸鹽氮去除效果最好的是C_2_1處理組,其次是C_1_1組,效果較差的是C_1_2組。

圖1 各個(gè)處理組水體中氨氮(TAN)質(zhì)量濃度變化Fig 1 Change of ammonia nitrogen(TAN) concentration in water of each treatment group

由圖1可知,每個(gè)處理組的氨氮質(zhì)量濃度在整個(gè)周期內(nèi)大體呈先上升后下降的趨勢,對照組在前期上升到7.48±0.45 mg/L后氨氮質(zhì)量濃度開始下降,直至試驗(yàn)后期維持在3～4 mg/L;生物絮團(tuán)處理組中,C_1_0組氨氮質(zhì)量濃度達(dá)到試驗(yàn)最高水平(9.79±0.35 mg/L);C_0_1組的氨氮質(zhì)量濃度始終維持在5 mg/L之下,氨氮去除效果較C_1_0組更明顯;混合碳源處理組的C_2_1組氨氮水平在整個(gè)試驗(yàn)周期始終維持在較低水平,最高質(zhì)量濃度僅2.43±0.45 mg/L,其次是C_1_1組,較差的是C_1_2組。綜合結(jié)果顯示