水產品中己烯雌酚殘留檢測方法

金麗瓊，張 睿，劉 妤，楊 靜

（甘肅省分析測試中心，蘭州 730000）

隨著中國經濟的快速發展，以及人們生活水平的日益提高，水產養殖業得到了快速發展。食品質量安全問題備受關注，特別是水產品中藥物殘留問題成為人們關注的重點，雖然國家食品安全標準已經對水產品飼料添加劑的使用做出了嚴格規定，但是大量使用違禁藥物的現象依然存在［1］。己烯雌酚是一種人工合成的非甾體雌激素類藥物，在水產品養殖過程中，將其添加在養殖飼料中可以很好地促進水產品的生長，從而有效縮短養殖時間［2］。同時己烯雌酚已經被研究者證實在水產品養殖過程中存在嚴重的殘留問題［3］，這種殘留會對人類和環境造成嚴重危害。國內外研究發現，己烯雌酚可以破壞機體的遺傳物質，導致基因突變，引發腫瘤［4］。由于己烯雌酚等激素藥物在水產養殖中的濫用，對水產品中己烯雌酚等激素藥物的殘留監測已經引起了全世界的高度重視。歐盟已經在食用性動物飼養中將其列為禁用品，2002年中國農業部發布的《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》（農業部公告第176號）中也禁止在畜禽水產養殖過程中使用己烯雌酚［5］。農業行業標準NY∕T 842—2021《綠色食品魚》中要求己烯雌酚不得檢出［6］。由此可以看出，己烯雌酚嚴重威脅著人們的食品安全，需要嚴格禁止其在水產品養殖過程中使用［7］，因此，分析水產品中己烯雌酚殘留檢測方法具有重要的意義。

1 己烯雌酚簡介

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），化學名為（E）-4，4′-（1，2-二乙基-1，2-亞乙烯基）雙苯酚，分子量268.35，分子式為C18H20O2，CAS：6898-97-1，沸點為（407.1±25.0）℃，結構式見圖1。己烯雌酚是一種人工合成的非甾體雌激素藥物，為無色結晶或白色結晶性粉末，難溶于水，易溶于醇及脂肪油。

圖1 己烯雌酚

2 己烯雌酚的檢測方法

水產品中己烯雌酚的檢測方法主要有酶聯免疫法、氣相色譜-質譜法和高效液相色譜-質譜法等。現將近10年報道的相關檢測方法分別進行分析綜述，分析現有檢測方法的優點和缺點，以及需要改進的技術難點。

2.1 酶聯免疫法

農業部1163號公告—1—2009《動物性食品中己烯雌酚殘留檢測酶聯免疫吸附測定法》中規定了標準的適用范圍是豬肉、豬肝、蝦樣本中己烯雌酚殘留量的檢測，該標準是一種快速篩選陽性樣品的檢測方法，如果出現陽性樣品時，還需要用儀器進行再次確認。該標準的方法原理是采用間接競爭ELISA方法，首先在微孔條上包被偶聯抗原，樣品中如果存在己烯雌酚，己烯雌酚就會與偶聯抗原競爭酶標板上的己烯雌酚抗體的結合位點結合，結合成功的己烯雌酚酶標記物可以將顯色劑顯色，顯色后的樣品通過酶標儀測定吸光度（450 nm 波長），吸光度與己烯雌酚含量形成負相關，通過與標準曲線比較后，就可以計算出己烯雌酚殘留的含量［8］。方法檢出限為2 μg∕kg，本方法在3～12 μg∕kg 添加濃度水平上回收率為60%～110%。該標準方法具有操作簡單、實際使用量少、適合大批量檢測任務的優點。

行業標準SC∕T 3020—2004適用于水產品肌肉中己烯雌酚的檢測，該標準的方法原理與農業部1163號公告—1—2009相同，方法檢出限為0.6 μg∕kg，回收率≥70%［9］。該標準方法靈敏度有所提高，但是樣品前處理過程需要用C18固相萃取小柱純化，前處理過程繁瑣。張瑞凌等［10］對現有標準中采用酶聯免疫法檢測己烯雌酚的方法進行了優化，樣品用乙腈提取，中性氧化鋁小柱凈化，用己烯雌酚ELISA 試劑盒檢測，簡化了前處理過程，方法檢出限為0.35 μg∕kg，加標回收率為77%～91%，可以滿足檢測要求，并采用液相色譜-質譜聯用法驗證了結果。

2.2 氣相色譜-質譜法

農業部1163號公告—9—2009 標準適用于水產品中可食部分中己烯雌酚殘留量的測定［11］。該標準的方法是用乙酸乙酯提取樣品中的藥物殘留，通過SLH 固相萃取小柱凈化樣品，再用硅烷化試劑進行衍生化后，用氣相色譜-質譜儀測定，外標法定量。 方法檢出限為0.5 μg∕kg，本方法添加濃度為0.5～10.0 μg∕kg 時，回收率≥70%。己烯雌酚沸點為407 ℃，已經超出了色譜柱的最高溫度325 ℃，因此，需要將己烯雌酚衍生成沸點較低的硅烷化衍生物進行檢測，該標準前處理過程復雜。尹怡等［12］在此基礎上分別建立了基質固相分散法、固相萃取法與氣相色譜-質譜聯用測定水產品中己烯雌酚殘留量的分析方法，其中基質固相分散法回收率大于90%，檢出限為0.3 μg∕kg；固相萃取法回收率大于80%，檢出限為0.5 μg∕kg；并比較了2 種前處理方法，發現基質固相分散法更簡便、省時、經濟環保。朱金蘭等［13］簡化了采用氣相色譜-串聯質譜法測定水產品中己烯雌酚含量時的前處理過程，樣品直接用乙腈、正己烷和乙酸乙酯提取，不需要通過固相小柱萃取，直接經BSTFA-TMCS 吡啶溶液在50 ℃衍生后，上機測定；該方法的定量限為0.5 μg∕kg，檢測限為0.1 μg∕kg。馬麗莎等［2］建立了QuEchERs∕Gc-Ms 法測定魚、蝦中雌二醇和己烯雌酚（DES）的殘留情況，該方法的平均回收率為86.1%～115.0%，檢出限（LOD，S∕N≥3）為0.3 μg∕kg；QuEchERs 處理方法與固相萃取法比較，縮短了前處理時間，減少了試劑的使用量，檢測過程經濟環保。

2.3 高效液相色譜-質譜法

國家標準GB∕T 22963—2008 適用于多種水產品中激素類藥物殘留的測定，該標準的方法檢出限為1.0 μg∕kg，方法回收率≥80%［14］。該標準方法適用范圍限制了液相色譜-串聯質譜法在水產品中己烯雌酚殘留量的檢測使用。李向軍等［15］建立了采用高效液相色譜串聯質譜法同時測定水產品中24種性激素的方法，樣品用乙酸乙酯提取2 次，硅膠柱凈化后，可同時測定24 種激素，其中己烯雌酚的定量限為1.0 μg∕kg，回收率大于80%。李佩佩等［16］建立了采用凝膠滲透色譜和固相萃取小柱凈化樣品后，用高效液相色譜法測定水產品中藥物殘留的分析方法，其中己烯雌酚的回收率大于80%，定量限為5.0 μg∕kg。王宏亮等［17］建立了配備有二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，同時對蝦中雌三醇、雌二醇、己烯雌酚等8 種雌激素進行鑒別和含量測定的方法，樣品經超聲提取，濾膜過濾，待測上機，該方法樣品前處理過程簡單，減少了化學試劑的使用，適合大批量檢測任務，并可以同時完成8 種激素的檢測，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限為0.09 μg∕mL。王丹華等［18］采用高效液相色譜儀實現了同時測定水產品中15 種激素殘留的檢測方法，樣品經超聲提取，濾膜過濾，直接用高效液相色譜分析，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限為0.09 mg∕kg，該方法實現了檢測水產品中的多種激素殘留，前處理過程簡單，靈敏度高。楊帆等［19］采用超高效液相色譜串聯質譜法測定水產品及其制品中3 種抗生素和14種性激素的殘留量，樣品經乙酸乙酯提取后，過GCB∕NH2固相萃取柱凈化，待測，其中己烯雌酚的回收率大于60%，定量限為3 μg∕kg。

2.4 其他方法

在酶聯免疫、氣相色譜儀串聯質譜和液相色譜儀串聯質譜檢測己烯雌酚的基礎上，盧安根等［20］提出了將熒光素酶報告基因檢測技術應用到水產品中己烯雌酚含量的測定，常用的檢測方法檢出限高，通常只能檢測一種激素的含量，該方法雖然前處理過程復雜，檢測成本較高，但是具有靈敏度高、可以同時檢測多種激素含量的優點，其中己烯雌酚的加標濃度為1.0×10-3μg∕kg 時，回收率為75%。呂楊等［21］將電致化學發光方法應用到水產品中己烯雌酚含量的測定，電致化學發光具有靈敏度高、重現性好、檢測設備簡單、適合大批量樣品檢測等優點，試驗結果表明，線性范圍為1～50 pg∕mL 時，線性相關系數為0.993，電致化學發光免疫傳感平臺的檢測限為1 pg∕mL，可以滿足己烯雌酚殘留量測定的行業標準。隨著分子印跡技術的快速發展，因其具有特異性識別的特點，也被應用到己烯雌酚的檢測技術中。何雨等［22］將分子印跡技術和新型熒光碳納米粒子技術應用到己烯雌酚的檢測方法中，在0.02～7.45 mg∕L 濃度內，方法檢出限為0.059 μg∕L，回收率在81.7%～110.3%，相對標準偏差小于10.7%。結果表明，該方法制備的己烯雌酚熒光印跡聚合物可以滿足己烯雌酚殘留量的檢測。

3 小結

目前可以參考的水產品中己烯雌酚的標準測定方法中，酶聯免疫法只適合快速篩選檢測，可疑樣品仍然需要用儀器進行確認。由于己烯雌酚的沸點較高，采用氣相色譜-質譜法檢測時，需要將己烯雌酚進行衍生后再檢測，存在前處理過程復雜的問題。高效液相色譜-質譜法靈敏度低，但方法檢出限高。因此，本研究通過解析現有標準方法存在的問題，綜述近10年報道的相關水產品中己烯雌酚檢測方法的研究進展，以期為建立前處理方法簡單、檢測效率高的己烯雌酚檢測方法提供一定的研究依據，為水產業綠色發展奠定基礎。