牛乳頭狀瘤病的診斷及其病毒基因型分析

張正剛，郭亞男，王建東，何生虎，李繼東

（1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.寧夏農林科學院動物科學研究所，銀川 750002）

牛乳頭狀瘤病（Papilloma viruses，PV）是由牛乳頭狀瘤病毒（Bovine papilloma virus，BPV）引起的牛常發病，為牛的體表皮膚或黏膜層慢性增生性皮膚病。乳頭狀瘤是良性腫瘤，通常為多型，已確定有13 個基因型，除了BPV-1 和BPV-2 可跨種屬誘發馬屬動物感染纖維乳頭瘤外，其他基因型均有嚴格的種屬特異性。另外，瘤體有纖維型和鱗狀型之分。

牛乳頭狀瘤是牛黏膜上皮細胞過度增生所形成，由乳頭狀瘤病毒導致的一種自限性皮膚傳染病［1］。該病從1929年發生并報道后，世界各地均有發生。在新疆、貴州、東北等地區也有該病的發生和報道［2，3］。牛乳頭狀瘤病毒屬于乳多空病毒科乳頭狀瘤病毒屬成員。顆粒的直徑為55～60 nm，無囊膜，長度為7000～8000 bp 的雙鏈閉環超螺旋DNA分子［4］。該傳染病沒有明顯的季節性，但在秋冬季多發。不同年齡、不同品種的牛均會發生，有些牛呈現較強的抵抗力；有些牛則特別敏感，乳頭狀瘤可能遍及全身各部位，且持續1年以上。該病不僅導致動物體能下降，而且影響皮革質量，疾病發生在生殖器會造成公牛和母牛的生殖功能損傷，引起生產性能下降，造成經濟損失。BPV 自然感染僅見于3～24月齡的犢牛。某些BPV 類型僅影響某些特定組織，并引起特定病變。如BPV1 與纖維腹狀瘤有關，BPV2 與皮膚疣和消化性纖維狀瘤相關，BPV3與皮膚狀瘤相關，BPV4 與上消化道純上皮狀瘤相關，BPV5 與乳房上的稻粒纖維狀瘤相關，BPV6 與葉狀瘤相關，BPV8 與皮膚狀瘤相關，BPV9 型和BPV 10 型與乳房鱗狀上皮狀瘤相關［5］。牛乳頭狀瘤是常見的良性腫瘤，在自然環境下與動物機體處于相互平衡的狀態，病毒不斷復制抵抗宿主的免疫應答，而機體通過增強免疫應答來清除源源不斷產生的病毒及感染的細胞，當機體抵抗力下降時，病灶持續蔓延，牛乳頭狀瘤則發生惡化，由良性腫瘤轉化為惡性腫瘤，導致發病牛死亡，給畜牧養殖業造成巨大的影響。

乳頭狀瘤病毒通常被描述為上皮嗜酸。病變主要是皮膚黏膜疣，是高產性感染的結果。牛乳頭狀瘤在牛的下頜部位、眼框、背腹部、尾巴和會陰部等皮膚處好發，以單個發生或呈串珠聯為主［6］。瘤體生長較為緩慢，從乳頭狀瘤的外觀形狀看，有蠶狀、栗子狀、圓球狀或花椰菜狀，質地堅硬，瘤體表面角質化［7］。花椰菜樣病變最常出現在頭部、頸部、側翼和腳的不同部位。若腫瘤生長于牛的體側，常因與其他牛發生碰撞或摩擦圈舍墻壁造成瘤體破潰［8］。BPV 的感染途徑多樣，直接接觸是傳播的主要原因［9］。一般來說，影響皮膚或黏膜的良性腫瘤會自行消退，但在一些環境或遺傳情況下，機體的防御系統可能不堪重負，誘發惡性腫瘤的發生。受影響動物生長遲緩，體重減輕和產奶量減少。

本研究針對寧夏回族自治區某規模化奶牛場多頭成年牛面部、頸部、軀干部等部位出現腫瘤塊，采用分子生物學技術開展病原診斷，采用病理組織學技術開展腫瘤塊病理組織學觀察和分析，發現本次病料分離的牛乳頭瘤病毒為2 型，將其命名為NXPL-1 毒株，以期為寧夏牛乳頭狀瘤病的科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 研究所采集的病料來源于寧夏回族自治區某規模化牛場，經臨床癥狀和診斷結果初步懷疑為牛乳頭狀瘤病。

1.1.2 主要試劑 D2000 Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；2 ×TaqPCR Master Mix、血液∕細胞∕組織DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自OMEGA 公司。

1.1.3 主要儀器 DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠；伯樂凝膠成像儀，美國伯樂生物科技有限公司；PCR 儀，美國應用生物系統公司；徠卡-2016 轉輪式切片機；JT-12S 自動組織脫水機，武漢俊杰電子有限公司；BMJ-A 型包埋機，常州郊區中威電子儀器廠；RS36 型全自動染色機，常州派斯杰醫療設備有限公司；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；Pannoramic 250 數字切片掃描儀，3DHISTECH（Hungary）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 采用75%乙醇對腫瘤及外周消毒，然后采用外科手術摘除感染牛皮膚表面瘤體，采集的乳頭狀瘤樣本置于50%甘油生理鹽水溶液中，低溫保存運輸［10］送至寧夏農林科學院動物科學研究所保存。

1.2.2 引物合成 基于NCBI 上公布的乳頭狀瘤病毒L1基因序列，由上海生工合成引物P1，5’-ATGGCGTTGTGGCAACAAG-3’；P2，5’-TTAAGCTTTGATTTTTTTTC-3’，產物長度1494 bp［11］。

1.2.3 樣品DNA 的提取 樣品置于超凈工作臺中室溫解凍，取200 mg 動物組織加入約3 倍體積的生理鹽水，充分勻漿后10000 r∕min 離心2 min 去除殘余組織。取300 μL 上清液至新的潔凈離心管中。參照“血液∕細胞∕組織DNA 提取試劑盒”說明書操作提取乳頭樣腫瘤組織基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

1.2.4 PCR 擴增及產物分析 采用合成引物對DNA 組 進行擴增，反應體 系 為50 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL（20 μmol∕L），2×TaqMaster Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。引物反應條件為預變性95 ℃2 min；變性95 ℃30 s，退火53 ℃20 s，延伸72 ℃2 min，30 個循環；72 ℃終延伸8 min。

按照上述程序對樣品DNA 提取物進行PCR 擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，用凝膠回收試劑盒純化回收PCR 產物，將PCR 純化產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 PCR 產物序列比對及分子進化分析 采用SeqMan Pro 軟件對擴增產物測序結果進行拼接，然后通過NCBI 網站的BLAST 程序進行相似性比對；將對比的序列從NCBI 下載并整理后采用MEGA7.0軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，進行遺傳進化分析。

1.2.6 組織病理學觀察 將采集的牛乳頭狀腫瘤物用4%多聚甲醛溶液固定14 d 后，固定組織經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片和HE 染色。染色結束后采用3DHISTECH（Hungary）生產的Pannoramic 250 數字切片掃描儀對切片進行圖像采集，并觀察具體病變。

2 結果與分析

2.1 奶牛乳頭狀瘤臨床癥狀觀察

臨床觀察發現乳頭狀瘤主要感染1～3 歲的青年牛，由圖1 可以看出，牛乳頭狀瘤主要集中在患病牛的頭部，另外頸部、胸腹部等皮膚均有乳頭狀瘤發生，顏色多呈灰白色或褐色。瘤體表面粗糙呈菜花狀、結節狀外觀，質地較為堅硬，容易破潰出血，切開瘤體后有烏黑色污濁液體從瘤體流出。通常幾個瘤在一起生長，有時連成一片，瘤體直徑0.5～8.0 cm（圖1）。

圖1 牛乳頭狀瘤臨床外觀

2.2 PCR 擴增結果

提取患病牛體表贅生瘤體樣品DNA，采用P1 和P2 引物進行PCR 擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出與預期大小相符的約為1494 bp 片段（圖2）。

圖2 牛乳頭狀瘤病料PCR 擴增結果

2.3 PCR 產物序列比對及分子進化分析結果

NXPL-1 毒株與其他12 株參考株應用MegAlign軟件與相似性較高的基因序列進行比對并且建立發育樹，L1基因是BPV基因組中比較保守的衣殼蛋白，通常用于各型病毒之間的基因分析，并采用NJ法構建BPV 系統進化樹（圖3），NXPL-1 株與BPV-2（M20219.1）和BPV-2（KM455051.1）菌株位于同一進化分支上，表明BPV NXPL-1 流行株屬于2 型乳頭 瘤 病 毒，與BPV-13（JQ798171.1）、BPV-13（MF327274.1）、BPV-13（KM258443.2）菌株親緣關系較遠。

圖3 BPV-NXPL-1 流行株L1 基因遺傳進化樹

2.4 病理組織切片結果

通過對患病奶牛皮膚乳頭狀腫瘤樣本石蠟組織切片制作、HE 染色鏡檢，顯示重度角質層增厚（黑色箭頭），局部可見角化不全（紫色箭頭）；表皮層棘層肥厚（黃色箭頭），皮突延長（紅色箭頭），表皮上部多見細胞質空泡化（藍色箭頭），局部可見上皮細胞點狀壞死，核碎裂或溶解（棕色箭頭）；真皮層可見少量淋巴細胞與中性粒細胞浸潤（綠色箭頭），局部可見毛細血管擴張（圖4）。

3 討論

對寧夏回族自治區一起奶牛乳頭狀瘤病進行病原分離、臨床觀察、病理組織切片，結合臨診資料確診。但由于BPV 分型較多，對組織的特異性也有差異，因此，應用分子生物學技術對BPV 進行型別鑒定也十分必要。測序與已上報的乳頭狀瘤病毒不同基因型做比對和遺傳進化樹分析發現，該規模化牛場發生的牛乳頭狀瘤病為2 型牛乳頭狀瘤病毒。

寧夏回族自治區極力打造生態畜牧，千億畜牧產業鏈，其中養牛業為自治區重點發展對象，先后從國外引進大量優良品種，以快速發展養牛業。但自發現BPV 后，牛群中尤其是犢牛發病呈快速上升趨勢，對畜牧養殖業危害較大。因為BPV 的嚴格種屬特異性，所以該病毒很難在體外培養［12］。據報道，可以在BPV 感染動物的血液、尿液、牛奶、精液和精子中檢測到該病毒的DNA，這就意味著在淋巴細胞、精液、尿液可能對BPV 的傳播具有潛在作用［13］，可能起病毒庫的作用。同一批次的冷凍精液培育的犢牛BPV 感染率明顯高于在相同環境下自然飼養的幼牛［12］。不同基因型導致牛的臨床癥狀也各不相同。還沒有研發出有效預防牛乳頭狀瘤病的商品化疫苗［14，15］，使得BPV 很難對其進行預防，主要還是通過手術治療。有證據表明BPV 類型的分布不遵循任何地理模式，無論其群體、性別和年齡如何。BPV 的遺傳多樣性與其致病性之間的關系尚不清楚［16］。因此，在今后的研究中應進一步探討BPV 不同基因型的發病機制和免疫力。

賀志昊［17］在新疆北部地區對6 種不同類型的BPV 對動物混合感染進行了報道，發現犢牛相比成年牛更易感，說明了BPV 的感染率與年齡有一定相關。這與本研究規模化牛場發病情況相一致。王青青等［18］檢測BPV 臨床的敏感性，對Aks-01 株使用了通用和簡并2 對引物進行檢測，均發現為BPV-2型；這與該牛場感染乳頭狀瘤的基因型一致。El-Tholoth 等［19］在埃及新谷省2 歲以下牛檢測出BPV-1 型感染，并開發驗證了一種簡單、易于使用的RPA-NALF 免疫測定法，適合用于實驗室外的快速診斷，可以在30 min 內出結果。

通過對寧夏回族自治區某規模化牛場BPV-2型NXPL-1 流行株的基因分析鑒定，為進一步研究BPV-2 型全長基因序列奠定基礎，對寧夏回族自治區乳頭瘤病毒基因數據庫建立有重要意義。