圍產期奶牛血清和乳清中RBP4 的調節變化

許志勇，李 雯，姜本政，信淑珍，朱 雯

（1.黑龍江省寶清縣農業農村局，黑龍江 寶清 155600；2.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036）

維生素A（視黃醇）對于機體多種生理過程至關重要，包括視力、免疫功能、生殖、胚胎發育以及細胞生長和分化［1］。視黃醇代表牛血中最豐富的類視黃醇［2］，即使給動物喂食不含維生素A 的飼料，其在公牛機體中的水平也至少可以維持145 d［3］。母牛和奶牛的血清視黃醇和β-胡蘿卜素水平在妊娠結束時下降，分娩時達到最低值，并在哺乳的第1 周再次增加［4］。血清視黃醇濃度的降低可能是由于大量視黃醇及其衍生物轉移到初乳中，導致類視黃醇在初乳中激增。

類視黃醇是分子量小的疏水性化合物，因此需要與可溶性蛋白質結合。視黃醇結合蛋白4（RBP4）是負責血漿視黃醇轉運的蛋白，并以1∶1 的比例與視黃醇結合。據報道RBP4 在小鼠中誘導胰島素抵抗［5］，并且人類血清RBP4 水平與葡萄糖耐量降低或2 型糖尿病患者的胰島素抵抗程度相關。STRA6 被鑒定為RBP4 的細胞表面受體［6］，表明RBP4 是一種新型的生物活性因子。但RBP4 在反芻動物機體內調節情況尚不明確，尤其是在奶牛初乳中是否存在RBP4，其調控方式是否與類視黃醇相似不明確。本試驗檢測了圍產期奶牛血清、初乳和常乳中RBP4和視黃醇濃度以及血清中INS 含量，以評估反芻動物血漿RBP4 和視黃醇水平的調節。

1 材料與方法

1.1 血清、初乳及常乳的收集

在黑龍江省某集約化牛場隨機選取體重450～550 kg 的未懷孕、未哺乳的荷斯坦奶牛（n=30），檢查未進食前血清RBP4、視黃醇和INS 水平。清晨未進食前從頸靜脈收集血液，離心（1500 r∕min）收集上清液后再離心（12000 r∕min）分離血清，并于-30 ℃保存。在同一牛場隨機選取懷孕的荷斯坦奶牛（n=30）。產犢前3～6 d，分娩當天以及產犢后7 d 和14 d 收集血清和乳清樣品。離心后-30 ℃保存。

1.2 血清和乳清中RBP4 的蛋白質印跡分析

參考文獻［7］純化牛RBP4，將純化的RBP4 免疫獲得血清抗體。血清用蒸餾水稀釋20 倍，乳清用蒸餾水稀釋10 倍。通過常規SDS-PAGE 電泳試驗（13%的濃縮膠）同時分離血清（7.5 mL）、乳清（24 mL）及純化后的RBP4。將蛋白質電印跡轉移到PVDF 膜（ImmobilonTM，Millipore，Bedford MA，USA）上。將膜在5%（W∕V）脫脂乳中封閉1 h，然后與抗RBP4 血清（1∶2000）在緩沖液中孵育48 ℃。用洗滌緩沖液洗滌5 次，并與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗 兔IgG 抗 體（1∶4000，Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco CA，USA）在室溫下孵育1 h。使用Image 程序以光密度法分析免疫反應條帶的表達強度。通過比較條帶灰度與純化的RBP4 強度來測量RBP4 濃度。

1.3 分光光度法測定血清和乳清中的視黃醇

通過文獻［8］描述的方法測定血清，將50 mL 乙醇和150 mL 己烷加入50 mL 血清和乳清中，混合40 min，并在12000 r∕min 離心10 min 后回收己烷?；诩和樘崛∥镌?25 nm 和453 nm 處的吸光度計算視黃醇濃度。

1.4 血清中INS 的檢測

利用商用INS 的ELISA 試劑盒（上海酶免公司）檢測試驗奶牛血清中INS 含量，根據說明書操作。

1.5 統計分析

結果表示為“平均值± 標準差（SEM）”。雙向重復測量ANOVA，其中P＜0.05 被認為差異顯著。利用SPSS 23.0 軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 RBP4 蛋白純化表達情況

如圖1 所示，純化的牛RBP4 條帶強度與蛋白質量密切相關，將10～80 ng 的RBP4 添加到牛血清和乳清后，純化的RBP4 分別以（96.2 ± 0.4）%和（95.4± 0.8）%回收。組間和組內差異小于5.1%和2.4%，表明純化的牛RBP4 可以用于后續試驗。

圖1 Western blot 對RBP4 的定量分析

2.2 分娩前后血清RBP4 和視黃醇水平變化

分娩前3～6 d血清RBP4水平為（50.7±5.3）μg∕mL，與對照組相比無顯著差異。分娩當天，RBP4 濃度顯著下降［（29.8±5.4）μg∕mL］，但分娩后14 d 恢復到產前水平［（52.1±2.1）μg∕mL］（圖2A）。分娩前血清視黃醇水平為（26.6±3.3）μg∕dL，與對照組相當。與RBP4 相似，分娩當天視黃醇水平顯著降低［（18.5±2.7）μg∕dL］，分娩后15 d［（33.9±4.3）μg∕dL］恢復到基礎水平（圖2B）。分娩前后的視黃醇∕RBP4 比值無顯著差異（圖2C）。

圖2 分娩前后奶牛血漿RBP4 和視黃醇水平的變化

2.3 分娩前后乳清中RBP4 和視黃醇水平的變化

在分娩前3～6 d 乳清中未檢測到RBP4 表達。在初乳中，RBP4 濃度為（16.4±5.6）μg∕mL（圖3A）。分娩后第7 天和第15 天，RBP4 從乳清中消失。乳清中視黃醇濃度［（分娩后7 d 為（43.5±6.9）μg∕dL］與血清視黃醇濃度相當，但初乳中的視黃醇濃度顯著升高［（295.3±5.9）μg∕dL］。初乳中視黃醇與RBP4的摩爾比為20∶1。

2.4 血清中INS表達情況及其與RBP4相關性分析

分娩前3～6 d血清INS水平為（0.32±0.01）ng∕mL，與對照組相比，無顯著差異。分娩當天，INS 濃度開始顯著下降［（0.27±0.02）ng∕mL］（表1）。產后14 d，INS 濃度為（0.34±0.01）ng∕mL，分娩當天INS 濃度與RBP4 水平呈正相關（R=0.84）。

表1 奶牛血清中INS 濃度

3 結論與討論

試驗首次證明了初乳中存在大量RBP4，但常乳中卻很少。初乳中RBP4 水平的增加伴隨著產犢當天血漿RBP4 的相應降低。由于RBP4 在常乳中幾乎不存在，因此RBP4 不太可能在乳腺中合成。RBP4 最有可能從血液轉移到初乳，導致血漿水平降低。在乳清中，乳球蛋白是視黃醇的載體，由于一分子RBP4 與一分子視黃醇結合［9］，初乳中視黃醇的存在比RBP4 濃度高近20 倍，表明乳球蛋白是初乳和牛奶中的主要視黃醇載體。尚不清楚初乳RBP4 作為視黃醇載體的生理相關性，但如嚙齒動物中所述，RBP4 作為代謝調節劑有助于小牛發育是合理的［5］。

Nonnecke 等［10］研究顯示，用不同量的維生素A飼喂犢牛，血漿視黃醇和RBP4 水平呈正相關。機體循環中視黃醇與RBP4 之間的相似關系在兒童和嬰兒中證實了［11］，提示RBP4 是視黃醇的替代標志物。在奶牛初乳中發現了大量的RBP4，同時血漿RBP4 下降，表明RBP4 是從血液轉運到初乳的。RBP4 和視黃醇水平在生理和病理生理條件下是獨立調節的。

人類醫學研究發現，RBP4 與多種代謝疾病的產生有密切關系，如常見的肥胖癥、糖尿病等，人體和嚙齒類動物體內的RBP4 主要通過激活機體的炎癥反應來抑制胰島素的抵抗［12］。本試驗結果表明，試驗奶牛血清中INS 與RBP4 呈正相關，表明在奶牛產后體內胰島素代謝與RBP4 密切相關，但其調控機制需要進一步研究。