玉米淀粉含量測定影響因素分析

沙米西努爾·牙森,李曉榮,蔡大潤,李 娟,劉志剛,楊 洋,李 波,陳勛基,陳果

(新疆農業科學院核技術生物技術研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米 (ZeamaysL) 是重要的糧用、飼用和工業原料作物。玉米在生長發育中光合作用過程產生的過量葡萄糖以淀粉的形式儲藏在淀粉體中并為植物種子、胚乳和塊莖的生長提供能源[1]。在玉米籽粒中,淀粉是玉米產量和品質的決定因素[2]。隨著直鏈淀粉的需求不斷增加,現有直鏈淀粉含量測定標準尚不能滿足玉米直鏈淀粉測定需求,在玉米淀粉檢測中,直鏈淀粉含量的測定有著嚴格的標準和要求,多是采用儀器法來測定,包括碘染色法、近紅外分析法,分析方法包括單波長分光光度計檢測和雙波長分光光度計檢測。其中雙波長分光光度計算方法準確度較高。與水稻、小麥不同,高直鏈淀粉玉米含量通常大于50%,分析玉米專用的直鏈淀粉含量鑒定方法對于專用淀粉加工產業具有重要意義。【前人研究進展】淀粉是由數百上千的單糖分子連接聚合而成的多聚體[3],主要位于種子、塊莖作物以及莖、葉、果實甚至花粉中[4]。根據分子結構差異淀粉分為直鏈淀粉(Amylose)和支鏈淀粉(Amylopectin)[5]。直鏈淀粉和碘分子形成淀粉-碘螺旋包合物并發生顯色反應,顯色程度主要由鏈長決定[6]。當直鏈淀粉的鏈長>80時,光的最大吸收波長大620 nm,直鏈淀粉螺旋狀卷曲越多束縛的碘離子數越多,直鏈淀粉與碘的顯色反應呈現深藍色。而支鏈淀粉遇碘液時碘分子只能與支鏈淀粉分支點外部的20幾個葡萄糖基結合,故呈紅到紫紅色。pH值對淀粉顯色反應影響也很大,淀粉溶液在不同的pH值下顯色情況也不同。淀粉與碘的顯色反應在pH值為3～5的弱酸性溶液中進行最靈敏,在pH<8的弱堿性溶液中次之,在pH>9的堿性溶液中不顯色[7]。在強酸性溶液中,反應呈現深藍(直鏈淀粉)或紅褐色(支鏈淀粉),發生不同顯色反應的原因是淀粉在強酸中會發生水解,產生糊精等,在不同的直鏈淀粉或支鏈淀粉溶液中糊精和碘分子作用呈現深藍色或紅褐色,在強堿性溶液中,堿將歧化成次碘酸鹽和碘化物,基本無單質碘的存在,因而不顯色;在弱酸性溶液中,碘不參與歧化反應[8]。【本研究切入點】玉米淀粉是重要的食品和工業原料,高直鏈淀粉玉米需求擴大,但目前尚無專門針對玉米直鏈淀粉檢測標準。需研究高直鏈玉米、普通玉米以及糯玉米等3種淀粉溶液中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量、pH值、波長、吸光度、吸光譜、淀粉顆粒結構等變化。【擬解決的關鍵問題】采用雙波長分光光度計測定不同玉米中直鏈淀粉、支鏈淀粉含量,比較不同玉米中淀粉溶液參比波長、吸光度和吸光譜,分析影響玉米淀粉含量測定的因素,確定使用雙波長測定高直鏈淀粉玉米中直鏈淀粉的含量。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 玉 米

高直鏈淀粉玉米、糯玉米、普通玉米(均由新疆農業科學院核技術生物技術研究所實驗室選育保藏)。

根據玉米籽粒淀粉工業加工用途,可以分為普通玉米,高直鏈淀粉玉米、糯玉米、高淀粉玉米,自交系B73屬于馬齒型普通玉米,糯玉米萬糯2018籽粒中有較粗的蠟質狀胚乳,較像硬質玉米和馬齒型玉米有光澤的玻璃質(透明)籽粒。高直鏈淀粉玉米G423籽粒為無光澤半透明。高淀粉玉米HS19-1籽粒表現為蠟質狀不透明。圖1

圖1 不同淀粉含量的玉米籽粒表型

1.1.2 儀器設備及試劑

離心機、pH測定儀、分光光度計、1 mol/L KOH、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、1 mol/L乙酸,0.2%碘液。亞硫酸、無水乙醇、丙酮、雙蒸水。

碘試劑:稱取碘化鉀2.0 g溶于少量蒸餾水,再加碘0.2 g,待溶解后用蒸餾水稀釋并定容至100 mL。

1.2 方 法

1.2.1 淀粉提取

玉米籽粒中淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種類型組成,普通玉米籽粒的直鏈淀粉和支鏈淀粉分別占總淀粉含量的22%～25%和75%～78%。高直鏈淀粉玉米是指直鏈淀粉含量均超過50%[9]。現有測定玉米不同淀粉使用國標水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測定法(GB 7648-87),該方法為單波長分光光度計測量法,通過樣品提取,繪制標準曲線,測定620 nm處吸光度。

將高直鏈玉米籽粒、普通玉米籽粒、糯玉米籽粒均15粒用體積分數0.25%的亞硫酸溶液(8 mL亞硫酸+192 mL蒸餾水)浸泡51 h,用小刀切除胚芽及剝去種皮,用研缽研磨,加水研磨成糊后經100 μm尼龍網過濾至50 mL的離心管。2 000r/min離心15 min,棄上清。沉淀中加0.2%的10 mL NaOH溶液混合均勻后,靜置4 h。在4 000r/min離心10 min,去上清,用0.2%的NaOH溶液重復洗滌至上清無色。加15 mL丙酮,在4 000r/min離心10 min去上清通風櫥內自然干燥后備用。

1.2.2 直鏈淀粉純化

稱量1 g玉米淀粉放置于含有10 mL DMSO水溶液的燒杯中(其中DMSO和蒸餾水的比例為4∶1),在用玻璃棒不斷攪拌溶液,直至乳液狀后,將燒杯放在60℃恒溫水浴中持續攪拌30 min后,再加入2 mL正丁醇后直接在常溫下放置。直至溶液中出現細針型沉淀后,以2 000 r/min、30 min的條件離心溶液。除上清,先加入2mL 2% NaCl,再緩慢加入2 mL正丁醇,并用渦旋振蕩器使溶液均勻,再以2 000 r/min、30 min的條件離心溶液。重復6次以獲得高純度直鏈淀粉,用真空冷凍干燥機干燥沉淀后研磨并保存在干燥器中。

1.2.3 標準工作液制備

稱取直鏈(支鏈)淀粉標準品0.1 g于100 mL燒杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;將燒杯置于60℃水浴中充分攪拌10 min,用蒸餾水定容至50 mL,即可得2 mg/mL濃度的直鏈(支鏈)淀粉工作液。

1.2.4 標準掃描液制備

取直鏈/支鏈淀粉標準工作液1、5 mL各置于100 mL燒杯中,加蒸餾水25 mL,以0.1 moL/L HCl溶液調pH值至3.5,再分別將溶液全部轉移至50 mL容量瓶中,加0.5 mL碘試劑,加蒸餾水至刻度。靜置10 min后搖勻后在分光光度計掃描兩種淀粉標準液的吸收光普并確定兩種淀粉的參比波長。

1.2.5 樣品工作液制備

稱取高直鏈玉米淀粉、普通玉米淀粉、和糯玉米淀粉各0.1 g于100 mL燒杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;將燒杯置于60℃水浴中充分攪拌10 min,用蒸餾水定容至100 mL,即可得1 mg/mL濃度的工作液。

1.2.6 淀粉溶液pH和吸光度測定

取5 mL的1 mg/mL直鏈淀粉溶液和普通淀粉溶液以及糯淀粉溶液(每隔樣品3次重復),分別加50 mL蒸餾水水稀釋,加入1 mL,1 mol/L HCl溶液,在pH測定儀測定3個品種加入鹽酸時的pH值并記錄,再分別加1 mL碘試劑,用蒸餾水定容至100 mL,顯色10 min后先用分光光度計掃描3種淀粉在400～800 nm處的吸收光譜并保存。再分別測定620、440、550和750 nm處的吸光度值。按同樣的方法NaOH代替KOH,乙酸替代HCl(濃度和體積一致)測定各樣品的pH、吸光度以及吸光普。

1.2.7 淀粉亞顯微結構

將已提取純化的高直鏈玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g裝進2.0 mL的離心管中視為對照組。將高直鏈玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g置于研缽中,各加2.0 mL 1 mol/L HCL并放置干燥箱干燥,干燥后的淀粉進行研磨并裝進2.0 mL的離心管中。利用掃描電鏡對兩組樣品進行分析。

樣品處理時先將導電膠帶黏結在樣品座上,再均勻地把粉末樣撒在上面,用洗耳球吹去未黏住的粉末,即可用電鏡觀察。操作過程中樣品的厚度要均勻,表面要平整,且量不要太多,1 g左右即可。

1.2.8 穩定性

取1 mL的1 mg/mL直鏈淀粉溶液和支鏈淀粉溶液(每個樣品3次重復),分別加50 mL蒸餾水水稀釋,加入1 mL,1 mol/L 乙酸溶液,再分別加1 mL碘試劑,用蒸餾水定容至100 mL,顯色10 min后測定支鏈淀粉和直鏈淀粉溶液每隔10 min后的吸光度。

1.3 數據處理

試驗數據用GraphPad Prism 9和SPSS 19等軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同淀粉含量玉米材料中籽粒表型

研究表明,普通玉米自交系B73直鏈淀粉含量為25%,支鏈淀粉含量為75.6%,高直鏈淀粉玉米材料G423直鏈淀粉含量為64.8%,支鏈淀粉含量為32.3%,糯玉米萬糯2018直鏈淀粉含量為1.9%,支鏈淀粉含量為97.1%。圖2

2.2 直鏈(支鏈)淀粉參比波長變化

研究表明,直鏈淀粉和支鏈淀粉的最高測定波長分別為620和550 nm,參比波長分別為750和440 nm。圖3

圖3 直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸收光譜變化

2.3 乙酸和鹽酸對淀粉溶液pH值的影響

研究表明,當3種淀粉溶液中加入乙酸時淀粉溶液的pH值在4.0 ～ 4.5;高直鏈玉米淀粉最高pH值為4.42,最低pH值為4.16,平均為4.30。普通玉米淀粉最高pH值為4.31,最低pH值為4.08,平均為4.20。糯玉米淀粉最高pH值為4.42,最低pH值為4.20,平均為4.31。而加入鹽酸時淀粉溶液的pH值在2.3 ～ 2.6,高直鏈玉米淀粉最高pH值為2.65,最低pH值為2.39,平均為2.54。普通玉米淀粉最高pH值為2.6,最低pH值為2.43,平均為2.49。糯玉米淀粉最高pH值為2.58,最低pH值為2.43,平均為2.50。加入乙酸和鹽酸后,三種淀粉溶液pH值顯著下降,乙酸和鹽酸對淀粉溶液pH值具有強烈的影響,其中乙酸對高直鏈玉米淀粉溶液pH值影響最大。圖4

注:***表示(P < 0.001),每個圓點表示一個數據點

2.4 乙酸和鹽酸對各淀粉溶液吸光度的影響

研究表明,在620 nm處高直鏈玉米淀粉溶液中加入乙酸時的吸光度平均值為0.843 9,而加入鹽酸時為0.956 7,在440 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.308 3,加入鹽酸時為0.365 9,在550 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.605 9,而加入鹽酸時為0.757 7,在750 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.392 9,而加入鹽酸時為0.499 4。

620 nm處普通玉米淀粉溶液中加入乙酸時的吸光度平均值為0.312 4,而加入鹽酸時為0.405 0,在440 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.194 2,而加入鹽酸時為0.266 4,在550 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.255 6,而加入鹽酸時為0.353 0,在750 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.169 3,而加入鹽酸時為0.220 0。

620 nm處糯玉米淀粉溶液中加入乙酸時的吸光度平均值為0.131 7,而加入鹽酸時為0.163 0,在440 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.158 8,而加入鹽酸時為0.186 9,在550 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.181 5,而加入鹽酸時為0.225 5,在750 nm處加入乙酸時的吸光度平均值為0.031 7,而加入鹽酸時為0.038 9。加入鹽酸后3種淀粉溶液在這4個波長處的吸光度值均高于加入乙酸時的吸光度值,高直鏈玉米淀粉溶液吸光度值大于普通玉米、糯玉米淀粉溶液。圖5

注:***表示(P< 0.001)。每個圓點表示一個數據點

2.5 乙酸和鹽酸對各淀粉溶液吸光普的影響

研究表明,當高直鏈玉米淀粉里加入乙酸時淀粉溶液在620 nm處的吸光度約為0.82,而加入甲酸時吸光度為0.92、當普通玉米淀粉溶液中加入乙酸時620 nm的吸光度約為0.315,而加入甲酸時吸光度為0.395左右、當糯玉米淀粉溶液中加入乙酸時550 nm處吸光度約為0.163,而加入甲酸時吸光度為0.223左右,高直鏈玉米淀粉溶液的吸光譜是最高的,并且加入鹽酸時的3種淀粉溶液的吸收峰高于加入乙酸時的吸收峰值。圖6

注:A:直鏈淀粉;B:普通淀粉;C:支鏈淀粉

2.6 鹽酸對普通玉米和高直鏈玉米淀粉顆粒結構的影響

研究表明,普通玉米淀粉分子呈不規則多面體形狀,表面光滑,且具有一定數量的棱角,大部分體積較大,部分淀粉顆粒表面具有微小凹坑。而高直鏈玉米淀粉顆粒表面相對圓潤,無明顯棱角但有部分褶皺和小突起,并未見明顯微小凹坑,大部分顆粒體積也相對較小,這些形態上的區別可能是直鏈淀粉與支鏈淀粉結晶結構不同導致的。與沒有鹽酸處理的普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉相比,鹽酸處理后的普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉晶體微觀結構有很大區別。具體表現為普通玉米淀粉顆粒膨大,表面凹凸不平,呈不規則形狀,高直鏈玉米淀粉顆粒結構改變沒有普通玉米劇烈。當淀粉溶液中加入鹽酸后導致淀粉顆粒晶體結構發生變化,淀粉溶液pH值、吸光度、波長等一系列理化指標的變化。圖7

注:B:高直鏈玉米淀粉亞顯微結構×2000倍掃描照片;C:HCl處理后普通玉米淀粉亞顯微結構2000倍掃描照片;D:HCl處理后高直鏈玉米淀粉亞顯微結構2000倍掃描照片

2.7 支鏈淀粉和直鏈淀粉水溶液穩定性比較

研究表明,支鏈淀粉在前50 min的吸光度基本上一直,吸光值約為0.136,在60 min的時候吸光值為0.135(P> 0.05)。而直鏈淀粉溶液隨著時間變化,吸光值變化呈現波動,前30 min吸光值增加,30 min后吸光值下降。在60 min內,直鏈淀粉吸光值波動范圍(0.60～0.64,P> 0.05)比支鏈淀粉(0.135～0.136,P> 0.05)劇烈。支鏈淀粉水溶液比直鏈淀粉穩定。圖8

注:A:支鏈淀粉;B:直鏈淀粉

3 討 論

研究中3種淀粉溶液濃度、碘液中I-濃度以及鹽酸、乙酸等溶液的濃度和體積一致,其中HCl是強電解質,乙酸是弱電解質,鹽酸溶液中C(H+)= C(HCl),乙酸溶液中C(H+)9的堿性溶液中不顯色。相同濃度和體積的鹽酸和乙酸溶液中,鹽酸中H+離子濃度大于乙酸中H+離子濃度,當淀粉溶液中加入等濃度、等體積的鹽酸和乙酸后加鹽酸時的淀粉溶液的pH值都明顯小于加乙酸時的pH值(P< 0.001)。

加入鹽酸的3種淀粉溶液吸光普和吸光度值也明顯區別于加乙酸時的吸收光譜和吸光度值(P< 0.001),可能是因為淀粉螺旋卷曲內部主要包含H+離子具有疏水性,當淀粉螺旋卷曲內部的氫離子越多淀粉束縛碘,鹽酸,乙酸等有機物的幾率越高,試驗過程中淀粉溶液中淀粉顆粒本身包含的氫離子和鹽酸中的氫離子使淀粉溶液具有更高的吸光度和吸光普。

淀粉顆粒大多為橢圓形、球形、圓餅形、多角形以及其他不規則的形狀[9]。研究通過電子掃描顯微鏡對普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉進行淀粉亞顯微結構比較并對經過鹽酸處理的普通玉米淀粉顆粒和高直鏈玉米淀粉顆粒微觀結構進行分析發現,普通玉米淀粉顆粒呈不規則多面體形狀,淀粉顆粒表面具有一定數量的棱角,且光滑,大部分體積較大,部分淀粉顆粒表面具有微小凹坑,可能是因為淀粉粒形成過程中部分酶所引起的,而高直鏈玉米淀粉顆粒表面相對圓潤,無明顯棱角但有部分褶皺和小突起,并未見明顯微小凹坑,大部分顆粒體積也相對較小,形態上的區別可能是兩種玉米品種所包含的直鏈淀粉與支鏈淀粉結晶結構不同導致的。鹽酸處理后普通玉米淀粉顆粒亞顯微結構和高直鏈玉米淀粉顆粒晶體結構較沒有鹽酸處理的普通玉米淀粉顆粒晶體結構和高直鏈玉米淀粉晶體結構有很大區別,鹽酸對淀粉顆粒結構影響很大。

穩定性試驗結果表明直鏈淀粉和支鏈淀粉溶液每隔10 min的吸光度變化情況穩定性不一樣。直鏈淀粉是一種微溶于熱水的碳水化合物,而支鏈淀粉易溶于水,支鏈淀粉的水溶液遠比直鏈淀粉穩定。直鏈淀粉含量測定實驗中常用的測定方法是淀粉溶液中加入碘試劑10 min后測定樣品的吸光度,因為隨著時間樣品中直鏈淀粉溶液的吸光度越不穩定導致測出來的淀粉含量不精確,測定直鏈淀粉含量過程中保證速度快、待測樣品少,若樣品多需分批測定來保證實驗的可靠性。

4 結 論

高直鏈玉米、普通玉米和糯玉米中直鏈淀粉淀粉含量分別為64.8%、25%和1.9%,支鏈淀粉含量分別為32.3%、75.6%和97.1%。在酸性條件下,3種玉米淀粉溶液pH值均降低,其中乙酸對高直鏈玉米淀粉溶液pH值影響最大,鹽酸處理后3種淀粉溶液吸光度值以及吸光譜均發生改變,尤其是直鏈淀粉吸光度及吸光譜高于支鏈淀粉,高直鏈玉米淀粉顆粒結構改變雖有變化,但沒有普通玉米劇烈,直鏈淀粉水溶液沒有支鏈淀粉水溶液穩定。