一起放牧羊群布魯氏菌病的分析檢測

金肖葉,葉 鋒,劉麗婭,馬曉菁,李 鑫,舒 展,陳 卓,鐘 旗

(1.新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學院獸醫研究所,烏魯木齊 830000;3.新疆阿勒泰地區動物疾控中心,新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病(Brucellosis),是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的一種以流產和發熱為特征的人畜共患傳染病[1-3],其為多種動物共患的二類動物疫病[4-5]。新疆是我國四大牧區之一[6-7]。通過流產羊群所在場圈舍布局、周邊環境、畜間分布等信息進行追溯與追蹤,對分析布病發病原因及傳染源有重要意義。【前人研究進展】布病常用的診斷方法有兩類,一類是病原分離鑒定或聚合酶鏈反應試驗(Polymerase Chain Reaction,PCR)等分子生物學方法[8],另一類是血清學診斷方法。Bricker等[9]開發的具有高靈敏度和特異性的聚合酶鏈反應是最早用于布病檢測的PCR方法。布病血清學檢測方法種類較多,因其操作簡單、快速、特異性高常用于臨床樣品檢測,主要有虎紅平板凝集試驗(Tiger red plate agglutination test,RBT)[10]、膠體金試紙條(Gold immunochromatographic assay,GICA)[11]、試管凝集試驗(Standard tube agglutination test,SAT)[12]、微量凝集檢測方法(Micro agglutination Test,MAT)[13]、間接酶聯免疫吸附試驗(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)[14]、競爭酶聯免疫吸附試驗(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)[15-16]和熒光偏振檢測技術(Fluorescence polarization assay,FPA)[17]等。【本研究切入點】國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646-2018)規定布病的初篩方法是RBT和iELISA,確診方法是SAT、MAT、cELISA,PCR。需研究應用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等8種方法,對放牧流產羊群進行布病檢測。【擬解決的關鍵問題】依據檢測結果,分析布病8種診斷方法的適用性,從養殖模式、年齡和性別等因素分析布病的流行風險因素,為放牧羊群布病的診斷防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 羊 只

2020年6月調查流產羊群所在場及周邊區域環境羊只養殖和布病監測及流產羊群的飼養管理、免疫、羊只流動及流產、死胎情況。

流產羊群所在場羊總存欄數為670只,其中成年羊590只,斷奶羔羊80只。

采集未經布病疫苗免疫的放牧流產羊群血清和抗凝血,按照置信區間可接受誤差5%的比例進行采樣[18],其中種公羊、后備公羊、年度有流產史的母羊血樣必采;每只羊采集全血和抗凝血3 mL。共采集3～5周歲成年羊血50份,3月齡羔羊血40份。

1.1.2 試 劑

RBT抗原、SAT抗原、布魯氏菌國家標準陽性血清與布魯氏菌國家標準陰性血清均購自哈藥集團生物疫苗有限公司;RBT抗原、SAT抗原、MAT抗原均購自中國獸醫藥品監察所;布魯氏菌病抗體快速檢測卡(簡稱膠體金檢測卡,GICA)購自韓國安捷Bionote公司;cELISA與iELISA試劑盒購自北京維德維康生物技術有限公司;FPA試劑盒購自哈爾濱平河生物技術有限公司;布魯氏菌病VirB8-PCR診斷試劑盒購自新疆畜牧科學院獸醫研究所。

1.2 方 法

使用RBT、GICA、SAT、MAT、cELISA、iELISA、FPA和RCR方法,對所采集的樣品進行布病檢測。表1

表1 檢測結果Table 1 Possible results of test

1.3 數據處理

研究選用敏感性、特異性、假陰性率、假陽性率、一致率和Kappa值6種分析指標對檢測結果進行分析[19],并用SPSS21.0統計軟件對數據進行統計分析。

符合率=[(a+d)/n]×100%;敏感性=(a/e1)×100%;特異性=(d/e2)×100%;假陰性率=(c/e1)×100%;假陽性率=(b/e2)×100%;

Kappa值={[(a+d)/n]-[(e1r1+e2r2/n2]}/{1-[(e1r1+e2r2)/n2]}。

Kappa系數<0,一致性極差;Kappa系數為0～0.2,一致性微弱;Kappa系數為0.21～0.4,一致性弱;Kappa系數為0.41～0.6,一致性中度;Kappa系數為0.61～0.8,一致性高度;Kappa為0.81～1.0,一致性極強。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果

2.1.1 不同診斷方法檢測羊血清陽性率

研究表明,初篩方法中iELISA檢出陽性率最高為25.56%,RBT檢出陽性率最低為8.89%。確診方法中cELISA檢出陽性率最高為24.44%,MAT檢出陽性率最低為14.44%。平均感染率為17.78%。表2

表2 不同診斷方法檢測羊血清陽性率Table 2 Results of different diagnostic methods

2.1.2 部分血清樣品布魯氏菌PCR檢測

研究表明,14份樣品PCR產物擴增出720 bp條帶,可確定為布病陽性樣品。圖1

注:M.DL2000 marker;1～14.部分血清樣品

2.2 檢測結果

2.2.1 血清學初篩方法的比較

研究表明,RBT陽性數均為8份,SAT陽性數均為16份,初篩方法以RBT檢測結果為對照,確診方法以SAT檢測結果為對照。

2.2.2 血清學初篩方法的Kappa值評價

研究表明,4種血清學初篩方法RBT、GICA、FPA和iELISA,敏感性均為100%,特異性RBT與GICA的特異性(96.34%)高于與FPA、iELISA的特異性(86.59%、81.71%)。RBT與GICA的一致性極強(Kappa=0.824)2種方法有較高的符合率(96.67%);iELISA與RBT、GICA、FPA的一致性中等(Kappa=0.443、0.577、0.628)符合率一般(83.33%、86.66%、86.67%)。表3,表4

表3 血清學初篩方法的比較(n=90)Table 3 Comparison of primary screening methods in serology(n=90)

表4 血清學初篩方法的Kappa值評價Table 4 The Kappavalue evaluation of the preliminary screening method in serology

2.2.3 血清學確診方法的比較

研究表明,SAT與cELISA的敏感性較高(93.75%)與MAT的敏感性(56.25%)較低,SAT與MAT、cELISA的特異性(94.59%、87.84%)較好。SAT與MAT、cELISA為中度一致性(Kappa=0.549、0.602)符合率一般,均有假陽性和假陰性。表5、表6

表6 血清學確診方法的Kappa值評價Table 6 Kappavalue evaluation of serological diagnostic methods

2.2.4 血清樣本

研究表明,母畜陽性感染率(29.68%)大于公畜陽性感染率(11.54%)。成年羊陽性感染率(42%)大于羔羊陽性感染率(2.5%)。 表7,表8

表7 不同性別羊只布魯氏菌病血清學 確診方法比較Table 7 Results of serological diagnosis of brucellosis in sheep by sex

表8 不同成長階段羊只布魯氏菌病 血清學確診方法比較Table 8 Results of serological diagnosis of brucellosis in different stages of growth

3 討 論

隨著家畜飼養量的不斷增加,動物及其產品的流通頻繁,部分地區布病發病率呈持續上升勢頭[20]。家畜易感布病的重要影響和養殖區域、年齡、性別、飼養方式、畜群規模及流產史等有關[21],家畜年齡是布病感染的潛在影響因素[22]。研究調查發現,成年羊的布病陽性率明顯高于羔羊(成年羊42%>斷奶羔羊2.5%),母畜陽性率高于公畜(母畜29.68%>公畜11.54%),有流產史的羊群患布病的風險更高。受季節和草場限制,新疆牧區牛羊養殖模式多為冬季全程舍飼,夏秋際集中放牧,也是造成布病區域性傳播的主要原因。應選擇適合當地的養殖模式,杜絕混牧,及時淘汰高齡家畜,最大程度降低家畜的感染風險[23]。

消除布病是一個系統而復雜的過程[24-25]。需加強檢疫、自繁自養,引進種畜或補充畜群時要嚴格檢疫[26]。

常用的布病檢測方法RBT、GICA、iELISA和FPA操作簡單[27-28],反應時間短,可用作初篩,但試驗容易受溫度的影響;SAT、MAT和cELISA可用作確診,但SAT操作復雜、費時,結果判斷受主觀因素影響[29];MAT操作簡便、成本低但也容易受主觀因素的影響[30];cELISA方法具有特異性高、敏感性強、操作簡單等優點,但是實驗試劑昂貴、需要特定的儀器[31-32]。目前分子生物學檢測技術已廣泛應用于布魯氏菌的檢測,PCR方法以其快速、準確、高效性已成為布病高效檢測方法之一[33-35]。在布病的日常監測中,面對不同區域、不同畜群、不同的免疫情況,多種血清學方法套用可提高檢測結果的全面性,再結合PCR檢測技術,經過多方法確診,更能確保檢測的準確性。

4 結 論

牲畜的養殖區域、養殖模式、年齡及性別都影響著羊布病的發生、發展。放牧羊群布病陽性率隨年齡增加呈上升趨勢(成年羊42%>斷奶羔羊2.5%);雌性羊布病陽性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流產史的羊群患布病的風險更高,成年雌性羊更易感染布魯氏菌。采用RBT、GICA、iELISA或FPA等方法進行初篩,再用SAT、MAT或cELISA、PCR等方法進行確診。

InvestigationofGrazingSheepBrucellosisand