基于LC/MS的伊犁馬3 600 m速度賽賽前、賽后血漿代謝組學差異變化

張仕琦,李曉斌,張文杰,韓 明,王世昌,鄭文祥,歐陽文,祁居中,楊開倫

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室,烏魯木齊 830052;2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場,新疆昭蘇 835000)

0 引 言

【研究意義】運動馬在不同生理活動(訓練、競賽)中,肌肉細胞收縮、能量消耗以及體內代謝產物的積累,導致力的下降,產生運動性疲勞[1],掌握機體運動過程中代謝產物變化情況,對于預防、恢復運動疲勞和提高運動性能有重要作用,能夠為運動馬的營養(yǎng)調控提供思路。代謝組學可以通過血液或尿液代謝產物的整體模式測定或指紋分析,進一步揭示機體代謝變化[2],對于馬匹運動性能的調控可能發(fā)揮積極作用。【前人研究進展】Enea等[3]利用代謝組學技術揭示長時間運動(75%的VO2max,直至耗竭)和短時間的運動(短期、密集性運動厭氧試驗)機體尿液代謝產物具有差異。Lehmann等[4]利用代謝組學方法鑒定出人在中等強度運動中,中等鏈酰基肉堿是具有促進脂肪氧化能力的主要生物標記物。Lewis等[5]利用質譜技術對運動員運動前后200多個代謝物進行了測定,得到了綜合的血漿代謝物特征。【本研究切入點】國內運動馬產業(yè)快速發(fā)展,國產運動馬運動性能上的差距以及運動性疲勞現象等問題日益顯現。隨著科技設備的發(fā)展,馬匹運動過程中的生理參數如心率、呼吸等能夠即時測定,但血液中的代謝物目前仍未能實現運動過程中的即時監(jiān)測,馬匹在運動過程中生化狀態(tài)變化的數據較難獲取,也未見報道。【擬解決的關鍵問題】試驗采用賽后即刻狀態(tài)趨近于運動過程中狀態(tài)的方法,應用非靶向代謝組學檢測分析技術,研究伊犁馬3 600 m速度賽前和賽后即刻血液中主要代謝物的差異變化,為運動馬運動過程中的代謝調控提供新的參考和思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 飼糧組成

根據馬場提供的遺傳系譜,挑選5匹(3♂+2♀)無親緣關系、體重(384.40±34.18)kg、年齡為2歲的正常速度賽用伊犁馬,試驗馬匹每日等強度訓練25 d后,于晨飼4 h進行3 600 m速度賽,試驗馬以(11.75±0.87)m/s的平均速度完成比賽。賽前安穩(wěn)狀態(tài)下和賽后即刻測定心率和呼吸頻率,采集血液、制備血漿樣品,采集血漿的質譜,采用非靶向性代謝組學方法進行代謝物的測定。表1

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平表(干物質基礎,%)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis,%)

試驗馬匹單廄飼養(yǎng),每天按時打掃馬廄。每天每匹試驗馬飼喂相同飼糧(8 kg干牧草和4 kg精料補充料)。每天分3次飼喂(07:00,15:00和22:00),先粗后精,自由飲水。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

分別在試驗正試期第25 d進行的3 600 m速度賽的賽前安穩(wěn)狀態(tài)下、賽后即刻(即馬匹完成賽程時立即采集血液),測定呼吸頻率和心率,采集頸靜脈血液(肝素鈉抗凝管)。血液以3 500 r/min離心10 min后收集上清血漿,分裝,液氮凍存。

1.2.2 樣品預處理

試驗樣本預處理:取100 μL血漿加入80%的甲醇水溶液400 μL,渦旋振蕩后在-20℃條件下靜置60 min,于14 000×g、低溫離心20 min,取上清取進行真空冷凍干燥,加入100 μL的復溶劑進行溶解殘留物,混勻后,于14 000×g、低溫離心15 min,正離子模式取上清液8 μL、負離子模式取上清液12 μL進行LC-MS分析。

質控(QC)樣本預處理:從每個已處理好的樣本中取等量上清液混勻作為QC樣本。blank樣本為試驗樣本的空白基質,樣本前處理過程與試驗樣本相同。

1.2.3 色譜和質譜分析

采用超高效液相色譜系統(Vanquish UHPLC)對10個樣品進行分離。柱溫40℃;流速:0.3 mL/min;正模式流動相組成:流動相A:0.1%甲酸,95%乙腈,10 mmol/L醋酸銨。流動相B:0.1%甲酸,50%乙腈,10 mmol/L醋酸銨。負模式流動相組成:流動相A:95%乙腈,10 mmol/L醋酸銨,pH9.0。流動相B:50%乙腈,10 mmol/L醋酸銨,pH9.0。分離后用QE HF-X質譜儀進行質譜分析。掃描范圍選擇m/z 100-1 500;ESI源的設置如下:Spray Voltage:3.2 kV;Sheath gas flow rate:35 arb;Aux Gas flow rate:10 arb;Capillary Temp:320 °C。Polarity:positive;negative;MS/MS二級掃描為data-dependent scans。表2

表2 色譜梯度洗脫程序Table 2 Chromatographic gradient elution procedure

1.2.4 游離氨基酸定量測定

取50 μL血漿加50 μL蛋白沉淀劑(含NVL),渦旋震蕩,13 200 r/min、4℃離心4 min去蛋白,取8 μL上清加入42 μL標記緩沖液和20 μL衍生液混勻,于55℃恒溫條件下衍生15 min后冷卻、離心,取50 μL上清進行LC-MS檢測。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0統計軟件的配對樣本t檢驗對心率、呼吸頻率和游離氨基酸定量數據進行差異分析,結果以“平均值±標準差”(mean±SD)表示,以P<0.05為差異顯著水平,P<0.01為差異極顯著水平,0.05≤P≤0.1具有差異趨勢。

非靶向代謝組學數據:將下機數據文件導入Compound discoverer(CD)搜庫軟件中,設置參數質量偏差0.005‰、信號強度偏差30%、信噪比3、最小信號強度100 000、加和離子等信息進行峰提取,用QC樣本對定量結果進行歸一化,對數據進行質控,得到質控合格的數據。分析PCA和PLS-DA。PLS-DA模型以變量投影重要度VIP>1.0,差異倍數FC>1.2或FC<0.833為差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 3 600 m速度賽前、后伊犁馬的心率和呼吸頻率變化

研究表明,試驗馬匹在3 600 m速度賽過程中心率、呼吸頻率顯著升高(P<0.05)。表3

2.2 代謝物質總離子色譜圖

研究表明,伊犁馬血漿經過正、負離子檢測,得到的兩個二維數據陣。數據陣中質荷比、保留時間及其峰面積等數據,在mzCloud數據庫中進一步對化合物精確定性和相對定量。圖1

表3 3 600 m速度賽前、后伊犁馬的心率 和呼吸頻率Table 3 Heart rate and respiratory rate of the Yili horse before and after 3 600 m speed race(bpm)

2.3 代謝差異產物

2.3.1 偏最小二乘法判別(PLS-DA)

研究表明,樣本都處于楠圓置信區(qū)間內,并且5個質控樣品能夠較好的聚類。賽前、賽后血漿樣品有明顯分開區(qū)域。試驗伊犁馬血漿正離子和負離子模式數據建立的PLS-DA模型的解釋率和預測能力強,且排序檢驗R2>Q2,解釋率大于該模型的預測率,模型未“過擬合”,模型可靠,能很好的描述樣本。圖2,圖3

2.3.2 代謝差異產物的篩選

研究表明,與賽前相比,伊犁馬賽后血漿甘油、檸檬酸、琥珀酸、精氨基琥珀酸、乳酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、尿酸、犬尿氨酸、胱氨酸、N-乙酰天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、乙酰左旋肉堿含量顯著升高(VIP>1.0)。血漿葡萄糖、D-葡萄糖-6-磷酸、亮氨酸、色氨酸、組氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、蘇氨酸、乙酰精氨酸、混旋肉堿、辣椒素、多巴胺含量顯著降低(VIP>1.0)。表4

2.4 游離氨基酸定量

研究表明,伊犁馬3 600 m速度賽賽后血漿氨基酸含量的變化較大,為進一步驗證,又進行血漿氨基酸定量測定。伊犁馬3 600 m速度賽賽后即刻與賽前相比血漿多種氨基酸含量產生顯著變化,其中:血漿Asp、Lys含量極顯著升高(P<0.01);Trp、His、Asn含量以及色氨酸/支鏈氨基酸比值極顯著降低(P<0.01);Ala含量顯著升高(P<0.05)。表5

注:A為正離子模式,B為負離子模式

注:圖中置信橢圓為95%。A為正離子模式,B為負離子模式,下同

注:R2:表示模型解釋率;Q2:表示模型預測能力

表4 伊犁馬3 600 m速度賽賽前賽后的血漿代謝差異物(n=5)Table 4 Plasma differential metabolites before and after 3 600 m Speed Race in Yili horse(n=5)

2.5 KEGG富集分析

研究表明,經過KEGG富集后,伊犁馬在3 600 m速度賽中檸檬酸循環(huán)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、五糖和葡萄糖醛酸間轉化、半胱氨酸與蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸降解、鞘脂代謝等途徑呈現顯著性變化(P<0.05)。表6

3 討 論

3.1心率30～42次/min,呼吸數8～16次/min是成年馬的正常閾值[6]。試驗馬匹在賽前心率和呼吸頻率在正常范圍內,馬匹的生理狀態(tài)穩(wěn)定。賽后即刻試驗馬匹心率和呼吸頻率達到較高水平,表明運動期間馬匹心肺功能快速運轉,增加血氧供應,促進機體氧化供能,使得血液中營養(yǎng)物質快速代謝轉換。利用非靶向代謝組學的方法對伊犁馬3 600 m速度賽賽前、賽后即刻兩個時間點的血漿代謝小分子進行測定,發(fā)現能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝等途徑在伊犁馬運動過程中呈現顯著性變化。

3.2伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿檸檬酸、琥珀酸含量上升。檸檬酸、琥珀酸是需氧生物體內能源物質的最終代謝通路—檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán),TCA)的重要物質,是有氧代謝供能的中樞環(huán)節(jié)。在三羧酸循環(huán)中乙酰膽堿和草酰乙酸生成的檸檬酸,檸檬酸的含量可反應機體內能源物質有氧氧化代謝的狀況。表明伊犁馬在3 600 m速度賽過程中有氧氧化參與代謝供能,加速了三羧酸循環(huán)的物質代謝。

3.3伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿葡萄糖含量下降,丙酮酸、乳酸含量上升。說明馬匹在劇烈運動時ATP快速分解供能且不斷消耗氧氣,當磷酸肌酸耗盡后,肌細胞逐漸呈現厭氧酵解狀態(tài),能量代謝轉為糖酵解途徑,分解糖原,產生大量乳酸[7-8]和丙酮酸。丙酮酸加氫還原成乳酸后繼續(xù)分解釋放ATP[9]。在運動員比賽過程中糖無氧供能加強,賽前、賽后乳酸和葡萄糖濃度顯著變化[10]。

伊犁馬3 600 m速度賽后血漿葡萄糖濃度降低。葡萄糖是機體內主要的供能物質,血漿葡萄糖濃度降低可能是因為肌肉運動刺激APMK通路,加速葡萄糖向肌肉轉運速度,以供肌肉氧化供能[11]。馬拉松運動員賽后[12]以及大鼠一次性力竭運動后[13]血清葡萄糖濃度也呈現顯著降低態(tài)勢。

表5 伊犁馬3 600 m速度賽賽前賽后的血漿游離氨基酸含量變化(n=5, μmol/L)Table 5 Changes of free amino acids in pasma before and after 3 600 m Speed Race in Yili horse(n=5, μmol/L)

研究中賽后即刻伊犁馬血漿乳酸濃度升高。乳酸是糖酵解的最終產物,機體運動導致無氧代謝增強,乳酸在體內不斷積累[14],使得血漿乳酸濃度升高。研究表明,運動員訓練后乳酸酵解能系統參與機體供能,血清中乳酸含量升高[10]。乳酸根離子(La-)與鈉(Na+)或鉀(K+)離子形成鹽,對肌肉細胞不構成威脅,但肌肉中H+的積累,降低pH能夠抑制肌動蛋白和肌球蛋白纖維的相互作用,以及抑制肌漿網中鈣離子(Ca2+)再攝取,可能延長肌肉收縮時間并導致疲勞[15-16]。乳酸是判斷運動性疲勞的標志物之一。

伊犁馬在3 600 m速度賽過程中供能方式不僅有葡萄糖和檸檬酸參與的有氧氧化,還有在耗氧狀態(tài)下,糖酵解系統逐漸參與機體供能,也逐漸積累了能夠引起降低力的乳酸。

3.4伊犁馬血漿各氨基酸含量賽前、賽后即刻出現顯著差異,伊犁馬在運動過程中血漿氨基酸含量有顯著影響。血液中氨基酸的濃度不高,但更新迅速,一些組織器官可以不斷地從血液中攝取/釋放氨基酸,尤其是骨骼肌[17]。機體運動時,血液多集中在肢體骨骼肌中,且隨著骨骼肌運動收縮,能量代謝,血液循環(huán)也加快,使得血液中氨基酸含量也發(fā)生變化。

伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿谷氨酸含量顯著升高,血漿谷氨酰胺含量顯著降低。可能說明在伊犁馬運動過程中機體谷氨酰胺快速分解用于供能產生的谷氨酸。谷氨酸和谷氨酰胺可在體內相互轉化,運動時谷氨酰胺可分解產生谷氨酸間接參與能量供應,運動強度越大谷氨酰胺濃度下降越快[18]。骨骼肌中谷氨酰胺持續(xù)下降被認為是過度訓練的指標之一[19]。Glu和Gln不僅能促進氨代謝,還可促進機體氧化供能。且運動時Glu+丙酮酸=Ala+α-酮戊二酸反應增強,可減少乳酸生成[20-21]。

伊犁馬3 600 m速度賽后血漿亮氨酸、色氨酸含量顯著降低,犬尿氨酸含量升高。亮氨酸屬于支鏈氨基酸,可參與供能。在運動過程中肌糖原減少,BCAA氧化參與供能,使得運動后血漿中BCAA濃度下降[22]。色氨酸是5-羥色胺(5-HT)的前體,腦內5-HT合成增加就是由于大腦吸收血液運輸傳遞的游離Trp而引起的,可調節(jié)神經興奮系統。在運動過程中BCAA濃度不僅與運動供能有關,也關系到腦中游離Trp的濃度,因為BCAA能競爭結合Trp在血腦屏障上的載體-白蛋白通道[23-24],BCAA被氧化為骨骼肌收縮過程提供的能量,導致BCAA減少,減少競爭抑制使得更多游離Trp進入到大腦中,利于5-HT的合成,造成中樞疲勞[25-26]。亮氨酸及其代謝通路對外周疲勞和中樞疲勞均可產生影響。亮氨酸、色氨酸及其涉及的代謝通路可作為營養(yǎng)調控的參考方向之一。

伊犁馬賽后血漿甜菜堿含量顯著降低。可能是在伊犁馬運動過程中甜菜堿參與了能量代謝。甜菜堿以及膽堿主要是機體甲基供給物,其中一條甲基供給路線是機體肌酸合成代謝,甜菜堿可反應生成蛋氨酸,然后在腺苷酶催化生成腺苷蛋氨酸(SAM)又經過S-腺苷蛋氨酸-胍基乙酸N-甲基轉移酶(GAMT)的催化下形成肌酸[27-28],參與磷酸原供能系統。因此甜菜堿-蛋氨酸循環(huán)也可作為營養(yǎng)調控的參考方向之一。

3.5脂質中包括甘油三酯和類脂,而甘油三脂由脂肪酸和甘油合成,作為骨骼肌的主要能量來源,與耐力運動性能的發(fā)揮有重要關系。可能由于機體中脂肪細胞缺少甘油激酶,運動中脂質分解產生的甘油,必須通過血液送至肝臟進行代謝[29],再參與三羧酸循環(huán)徹底氧化供能(氧充足)或糖異生產生乳酸(供氧不足)。伊犁馬在運動過程中機體脂質也參與了分解供能,使得血漿甘油含量升高。

運動時糖酵解系統供能比例增加,并且當生成CoA的速率大于檸檬酸的利用率時,肉堿則充當乙酰基的受體生成乙酰肉堿[30],伊犁馬3 600m速度賽后血漿混旋肉堿含量降低,乙酰左旋肉堿含量顯著升高。左旋肉堿是可運輸脂肪酸進入線粒體進行TCA和β-氧化循環(huán)[31]。研究證明,適當補充左旋肉堿可改善脂肪代謝,進而改善機體有氧能力[32]。肉毒堿也可作為營養(yǎng)調控的參考方向之一。

伊犁馬在3 600 m速度賽中參與能量供應的代謝物變化最為顯著。運動前期磷酸原供能系統快速供能[33],甜菜堿、蛋氨酸參與肌酸合成,運動前后變化顯著。磷酸原供能短暫時間后轉變?yōu)橛醒跹趸┠?線粒體三羧酸循環(huán)供能、葡萄糖氧化、氨基酸(支鏈氨基酸)氧化、脂肪氧化加強,促進肌肉供能。隨后氧氣供應不足,供能方式轉變?yōu)樘墙徒夤┠堋＿\動后期主要依賴脂肪(甘油)經過甘油激酶等催化作用生成磷酸二羥丙酮作用下進行糖酵解或者參與β-氧化供能。伊犁馬在比賽期間呈現無氧、有氧以及混氧的代謝特點。因此,在考慮調控運動馬運動性能方面,提高馬匹運動過程中供能物質的供給具有重要意義。其次,運動過程中糖酵解供能時間較長,乳酸、氨等代謝物的堆積導致力的衰減,減少代謝廢物的堆積以及加速代謝物的排出對于運動性能的提高以及運動后疲勞恢復也很重要。谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸等功能性氨基酸可能對于代謝廢物的排出或減少產生有積極作用。結合試驗結果,供能物質亮氨酸、甘油、蛋氨酸、甜菜堿以及功能物質色氨酸、谷氨酰胺、肉毒堿這幾類物質涉及的調節(jié)通路可能為運動馬營養(yǎng)調控提供參考。

4 結 論

基于LC/MS伊犁馬血漿代謝組學的分析,3 600m速度賽伊犁馬機體呈現出無氧、有氧以及混氧代謝的特點。伊犁馬3 600 m速度賽前、賽后血漿樣本的LC/MS代謝譜存在差異,涉及檸檬酸循環(huán)、糖酵解系統以及脂肪代謝、氨基酸代謝等過程。其中,亮氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甜菜堿、甘油、肉毒堿這幾類物質涉及的調節(jié)通路可能為運動馬營養(yǎng)補劑的研發(fā)提供參考。