環狀RNAs-000911對三陰性乳腺癌細胞株活性的影響

【摘要】" 目的" 探討環狀RNAs（circRNAs）-000911對三陰性乳腺癌細胞株活性的影響。方法" 培養80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，分為000911小干擾RNA組（circRNAs-000911組）和陰性對照組（si-NC組），各40株。將circRNAs-000911組和si-NC組分別轉染到對應的MDA-MB-231細胞內。轉染后以實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測兩組細胞內的circRNAs-000911表達水平，以細胞計數試劑盒檢測兩組細胞的活性，以EdU實驗檢測兩組細胞的增殖能力，以Transwell小室實驗對兩組細胞的遷移和侵襲能力進行檢測。結果" 經過轉染后，circRNAs-000911組內的circRNAs-000911表達水平明顯低于si-NC組，細胞OD值、細胞陽性率明顯高于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；轉染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論" 抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞circRNAs-000911表達，能夠明顯增強MDA-MB-231細胞的活性和增殖能力，有效控制MDA-MB-231細胞遷徙和侵襲的能力。

【關鍵詞】" 環狀RNA-000911；三陰性乳腺癌；MDA-MB-231細胞株；細胞活性

中圖分類號" R737.9" " 文獻標識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）12--04

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤，在全球女性腫瘤的發病率高居第1位，同時也是女性癌癥死因的第2位[1]。三陰性乳腺癌是孕激素受體、人類表皮生長因子受體2和雌激素受體均為陰性的乳腺癌，其惡性程度較高，容易出現轉移[2]。盡管臨床上對于乳腺癌的治療和診斷已經取得了長足發展，但三陰性乳腺癌患者仍然存在較高的復發率，且在5年內的死亡率也較高，因此對于三陰性乳腺癌的快速診斷和治療生物靶標的研究是近些年的研究重點[3]。環狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一種存在體內的非編碼RNA，有調節的功能，同時也是RNA異常剪切而生成的[4]。隨著臨床上對于遺傳學的研究加深，circRNAs也被逐步運用在腫瘤學的檢測當中，且有越來越多的研究認為circRNAs在腫瘤的進展中發揮重要作用[5]。有關三陰性乳腺癌與circRNAs的關系目前鮮有研究[6]。本研究旨在探討circRNAs-000911對三陰性乳腺癌細胞株活性的影響，為三陰性乳腺癌的腫瘤標志物和靶標提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑與儀器

80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自美國ATCC公司的細胞庫。000911小干擾RNA和陰性對照購自于廣州瑞博奧生物科技有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及U6引物購自于上海吉至生化科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒、Trizol試劑、青霉素鏈霉素雙抗、胎牛血清、RNA純化試劑盒、5-乙炔基-2脫氧尿嘧啶核苷以及DMEM培養基均購自于上海優寧維生物科技股份有限公司。PrimeScript RTRT反轉錄試劑盒購自于日本Takara公司。Transwell小室購自于安捷倫科技（中國）有限公司。基質膠購自于廈門模基生物科技有限公司。熒光定量PCR儀、酶標儀和核酸蛋白測定儀購自于上海優寧維生物科技股份。

1.2" 細胞培養

80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株分為000911小干擾RNA組（circRNAs-000911組）和陰性對照組（si-NC組），各40株。采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，陰性si-NC組則運用MEBM培養基。兩種細胞都于37℃和5%CO2體積分數下進行培養，每3天更換次培養基，細胞融合率大于80%時即進行細胞傳代從而進行后續實驗。

1.3" 細胞轉染

獲取對數生長后的MDA-MB-231細胞，將其濃度調整為4×104/ml，并接種到6孔板內，si-NC組和circRNAs-000911組各設置3個復孔。各組細胞貼壁度gt;70%后則根據說明書完成細胞轉染。si-NC的序列：正向引物：5'-AGGUUUACAUGUUCCAAUAUG-3'，反向引物5'-UAUUGGAACAUGUAAACCUGG-3'；circRNAs-000911：正向引物：5'-GGUUUGUUGUUG UUCUUAUU-3'；反向引物：5'-UUAAGAACAACAAC AAACCAA-3'。轉染完成后將兩組細胞繼續進行培養，持續轉染6h后更換為DMEM培養基，再次轉染48h后對細胞進行收集以進行后續的實驗。

1.4" circRNAs-000911表達水平檢測

轉染48h后收集兩組MDA-MB-231細胞到離心管內，通過PBS清洗并高速離心去除上清液后，將其加入到Trizol試劑并放在冰上進行裂解，將200μl三氯甲烷加入各組樣品內，萃取后在15000r/min下高速離心15min。獲得400μl上清液，通過異丙醇使水相內RNA沉淀，再次進行15000r/min高速離心，連續離心10min，隨后以75%乙醇將RNA洗滌并沉淀，再次以7500r/min高速離心5min，舍棄上清液后。在室溫內干燥，隨后加入DEPC水，保存于-80℃下。通過酶標儀對RNA的濃度以及純度進行測定。按照說明書將RNA反轉錄為cDNA，在30℃下30min，在70℃下10min，在4℃下5min。實時熒光定量聚合酶聯反應的條件為：在95℃下反應5min；在95℃下反應25s，在60℃下反應25s，在72℃下反應5min，以上反復40個循環；在72℃下反應5min。獲得溶解曲線，檢測目的基因為各組細胞內熒光閾值，以2-△△Ct法進行計算，計算各組基因的相對表達量。

1.5" 細胞活性檢測

收集兩組轉染48h后的MDA-MB-231細胞，每孔400個細胞并接種在96個孔板內，根據CCK-8試劑加入的時間分為4個亞組，各組均設置3個復孔。各組細胞都于37℃和5%CO2體積分數下進行培養，在培養前以及培養后24、48、72h對96孔板的培養基進行吸取，各孔內加入90μl的DMEM培養基和10μl的CCK-8試劑，試劑加入后再次孵育2h，通過酶標儀對各組細胞的光密度值進行測定，其能夠反映出細胞的活性。

1.6" 細胞增殖能力檢測

收集兩組轉染48h后的MDA-MB-231細胞，每孔400個細胞并接種在96個孔板內，以各孔5×103細胞將其接種到96孔板內，各組3個復孔。各組細胞都于37℃和5%CO2體積分數下培養3h，根據EdU試劑盒說明書對MDA-MB-231細胞增殖能力進行檢測。兩組細胞通過甲醛固定，隨后以PBS將甲醛洗去，隨后孵育20min。向各孔內加入1ml細胞染色劑并在暗處孵育25min。通過PBS反復洗滌3次，將染色液洗出。隨后以熒光顯微鏡進行染色標記細胞計數和拍照。染為紅色的則是陽性，也說明有更高的活性。

1.7" 細胞侵襲和遷移能力檢測

采用有8mm孔徑小室的24孔板，同時將100μl基質凝膠以DMEM培養基稀釋，各孔100μl加入至24孔板上室內過夜。收集兩組轉染48h后的MDA-MB-231細胞，以各孔1×103細胞將其接種到24孔板上室，下室加入600μl的DEME培養基，各組均設置3個復孔。各組細胞都于37℃和5%CO2體積分數下培養24h，隨后以棉簽將上室沒有侵入的細胞擦拭掉，在室溫條件下固定細胞，隨后以結晶紫染色。顯微鏡下觀察，并對侵襲細胞數目進行計算。

1.8" 數據處理方法

應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以“±s”的形式表示，組間均數比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料組間率比較采用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 兩組MDA-MB-231細胞內circRNAs-000911表達水平比較

經過轉染后，circRNAs-000911組的circRNAs- 000911表達水平明顯低于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2" 兩組MDA-MB-231細胞活性比較

轉染后兩組細胞在0、24和48h時OD值差異無統計學意義（Pgt;0.5）；在轉染后72h時，circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞OD值明顯高于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。見表2。

2.3" 兩組MDA-MB-231細胞增殖能力比較

轉染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞陽性率明顯高于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.4" 兩組MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力檢測

轉染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

3" 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌中較特殊的一種，有高復發率和死亡率的特點。由于此類患者的孕激素受體、人類表皮生長因子受體2和雌激素受體均為陰性，導致其抗人類表皮生長因子受體2靶向藥和內分泌藥物治療的效果較差，臨床上對其也主要以化療進行治療[7-8]。因此，對于三陰性乳腺癌的新型診斷和治療生物標志物是近些年的研究重點，本研究為此而展開討論。

隨著RNA技術和生物學技術的進步，ncRNA成員之一的circRNA也被逐步運用在多種癌癥的檢測當中[9]。circRNA具有特殊的環狀結構，這也使其具有高穩定性的特點，并且其主要分布在真核生物內，具有組織和細胞的特異性[10-11]。已有研究發現，circRNA在乳腺癌、肺癌、胃癌和肝癌等癌癥的發生中發揮著較高的作用[12]。胡夢婷等[13]研究發現，circRNA-0000231能夠對乳腺癌細胞的侵襲、遷移和增殖進行有效的抑制，同時還能夠促進腫瘤細胞凋亡，對細胞的周期進行阻滯。circRNA-000911是circRNA的一種，能夠特異性海綿化miR-449a，并且釋放Notch1對乳腺癌細胞的增殖、遷移和分化進行抑制。本研究通過000911小干擾RNA轉染后，circRNAs-000911組的circRNAs-000911水平明顯低于si-NC組。對轉染后的細胞活性檢測發現，在轉染后72h時，circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞OD值明顯高于si-NC組。提示，抑制circRNAs-000911的表達會明顯增強乳腺癌MDA-MB-231細胞的活性，促進腫瘤的生長發育。MiR-449a能夠增強細胞活性以及乳腺癌細胞的侵襲能力，而其能夠逆轉circRNAs-000911誘導腫瘤抑制的功能，可見circRNAs-000911能夠抑制miR-1449a活性，進而發揮抑制乳腺癌細胞的作用[14-15]。本研究結果顯示，轉染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞陽性率明顯高于si-NC組。提示，對circRNAs-000911表達進行抑制，能夠明顯提高乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖能力。同時進一步進行細胞侵襲和遷移能力檢測發現，轉染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統計學意義。這也進一步證實了circRNAs-000911在三陰性乳腺癌中的作用，對其進行抑制能夠明顯提高腫瘤細胞的遷移率和侵襲率。但本研究僅僅降低了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的表達，并未進行高表達circRNAs-000911后，三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞活性、增殖、遷移和侵襲功能的差異。

綜上所述，抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞circRNAs-000911表達，能夠明顯增強MDA-MB-231細胞的活性和增殖能力，有效控制MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的能力。

4" 參考文獻

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[2023-04-10收稿]