miR-146a-5p及miR-9-3p對(duì)炎癥反應(yīng)及脂代謝調(diào)節(jié)因子的作用

【摘要】 "目的 "通過檢測(cè)microRNA-146a-5p（miR-146a-5p）、microRNA-9-3p（miR-9-3p）對(duì)HepG2細(xì)胞白介素受體相關(guān)激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding gassette transporter A1，ABCA1）蛋白水平表達(dá)的影響，探討miR-146a-5p及miR-9-3p對(duì)炎癥反應(yīng)及脂代謝調(diào)節(jié)因子作用。方法 "以HepG2細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，分別進(jìn)行miR-146a-5pmimics 轉(zhuǎn)染及miR-9-3pmimics轉(zhuǎn)染，采用Western blot檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)的影響及miR-9-3p對(duì)HepG2細(xì)胞ABCA1蛋白水平表達(dá)的影響。結(jié)果 "miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白水平顯著低于對(duì)照組；miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1的蛋白水平顯著低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。結(jié)論 "miR-146a-5p能夠顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)，miR-9-3p能夠顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞ABCA1的蛋白表達(dá)，miR-146a-5p及miR-9-3p可能在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)及脂質(zhì)代謝中起到重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 "microRNA-146a-5p；microRNA-9-3p；白介素受體相關(guān)激酶-1；ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1；蛋白免疫印跡

中圖分類號(hào) "R587.1 " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 "A " "文章編號(hào) "1671-0223（2023）04--03

糖尿病是一種代謝性疾病，其中高糖環(huán)境下體內(nèi)炎癥反應(yīng)以及糖脂代謝往往是相互影響的，有研究顯示，在體內(nèi)高糖水平下炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子及脂代謝調(diào)節(jié)因子會(huì)發(fā)生表達(dá)水平的改變，影響體內(nèi)正常炎癥調(diào)節(jié)及脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[1-3]。在循環(huán)系統(tǒng)中的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），其中因子之一miR-146a-5p具有炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用。研究人員在糖尿病患者外周血細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其外周血細(xì)胞中的miR-146a-5p表達(dá)水平是顯著下降的[4-5]。循環(huán)系統(tǒng)中的miR-9-3p是一類參與代謝過程的miRNA，在體內(nèi)的葡萄糖及脂類代謝過程中發(fā)揮作用，糖脂代謝紊亂與胰島素抵抗及胰島素水平分泌減少相關(guān)[6-7]。IRAK-1因子經(jīng)研究證明其具有參與炎癥反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)免疫因子表達(dá)[8-9]發(fā)揮擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的作用。ABCA1是介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子，能夠在膽固醇代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究通過檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)IRAK-1蛋白表達(dá)的影響，miR-9-3p對(duì)ABCA1蛋白表達(dá)的影響，探討miRNA對(duì)于炎癥反應(yīng)及脂代謝調(diào)節(jié)的作用。

1 "材料與方法

1.1 "實(shí)驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供。實(shí)驗(yàn)分為三組，miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimics；miR-9-3p轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-9-3p mimics；對(duì)照組：細(xì)胞系體外培養(yǎng)不進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件與各轉(zhuǎn)染組相同。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)兩組副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次取均值。

1.2 "細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞復(fù)蘇后的試管使用滴管緩慢加入適量的DMEM培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清），將細(xì)胞稀釋成105/ml的濃度，之后緩慢轉(zhuǎn)移至預(yù)先消毒的培養(yǎng)瓶之中，并且將培養(yǎng)瓶放置于濃度為37%的CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，24h后進(jìn)行更換培養(yǎng)液操作，將培養(yǎng)瓶放置于倒置顯微鏡之下進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞生長形態(tài)良好，待細(xì)胞生長達(dá)到鋪滿瓶壁即可傳代。

1.3 "細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將配制好的miR-146a-5pmimics、miR-9-3pmimics轉(zhuǎn)染復(fù)合物，各吸取出250μl，分別緩慢的加入到已經(jīng)培養(yǎng)好的細(xì)胞孔板中，再緩慢的吸取Opti-MEM培養(yǎng)基，達(dá)到750μl/孔，輕輕加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中。轉(zhuǎn)染過程中要輕柔的搖勻細(xì)胞板至各細(xì)胞孔板混合均勻。緩慢轉(zhuǎn)移，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫度為37℃、濃度為5.0﹪CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)到6h后緩慢的吸取體積為1ml普通的DMEM培養(yǎng)基，其中DMEM中含有比例為20%胎牛血清、并且無抗生素成分，緩慢加入各孔。

1.4 "Western blot細(xì)胞總蛋白的提取

細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，輕柔的應(yīng)用PBS清洗3次，再應(yīng)用RIPA裂解，裂解細(xì)胞進(jìn)一步獲得細(xì)胞中總蛋白成分。再應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定所提取的蛋白濃度，后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取目的蛋白條帶，在恒流200mA條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)完成后，將膜用TBST水清洗，放入封閉液中，并且在搖床上封閉1h。按比例為1∶100或1∶200的比例進(jìn)行配制一抗與一抗稀釋液。將封閉好的膜輕柔放入按上述比例配好的一抗稀釋液中，在溫度為4℃的環(huán)境中進(jìn)行搖床過夜。按1∶1000或1∶2000的比例進(jìn)行配制二抗與二抗稀釋液，緩慢的將膜放入按上述比例配好的二抗稀釋液，溫度為常溫在搖床上輕柔勻速搖3h。二抗孵育完成后，經(jīng)TBST洗3次，加顯色液并且在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并仔細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 "數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。正態(tài)分布的計(jì)量資料使用“±s”表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1 "miR-146a-5p對(duì)HepG2 細(xì)胞IRAK-1蛋白水平的影響

miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白表達(dá)水平為0.528±0.074，對(duì)照組IRAK-1蛋白表達(dá)水平0.733±0.051，miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 "miR-9-3p對(duì)HepG2細(xì)胞 ABCA1蛋白水平的影響

miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1的蛋白水平為0.505±0.073，對(duì)照組ABCA1的蛋白水平0.719±0.095，miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1蛋白水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

3 "討論

在人體血液循環(huán)、組織液、淚液等循環(huán)系統(tǒng)中存在大量miRNA，目前的研究表明miRNA是一類非編碼的單鏈小RNA分子，其功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)多種蛋白類物質(zhì)的表達(dá)。在生長發(fā)育期及疾病過程等相對(duì)非穩(wěn)態(tài)時(shí)，miRNA表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯的變化，發(fā)揮其調(diào)整蛋白質(zhì)表達(dá)的作用，在穩(wěn)定狀態(tài)下，其表達(dá)量也相對(duì)穩(wěn)定，這就為研究疾病時(shí)miRNA表達(dá)水平奠定基礎(chǔ)。目前的研究報(bào)道提示，在疾病狀態(tài)下，細(xì)胞中miRNA會(huì)釋放入血或過量代謝，使血漿中miRNA的變化要早于蛋白類標(biāo)記物[10]，以上特點(diǎn)使血漿miRNA具有成為全新疾病檢測(cè)標(biāo)記物的潛能。

miR-146a-5p在目前的研究中證實(shí)其具有免疫調(diào)節(jié)功能，在促進(jìn)炎癥修復(fù)以及抑制慢性炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要的作用[11-12]，糖尿病患者體內(nèi)長期處于一種慢性的低度炎癥反應(yīng)的狀態(tài)，慢性炎癥過程能夠加速線粒體凋亡，導(dǎo)致胰島細(xì)胞壞死，減少胰島素分泌，炎癥反應(yīng)還能夠促進(jìn)胰島素抵抗[13]。糖尿病模型小鼠其胰島β細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)顯示miR-146a-5p表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步研究其功能顯示，過量表達(dá)miR-146a-5p能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)。人類的IRAK-1基因位于Xq28位點(diǎn)，在機(jī)體自身免疫中通過激酶激活一系列炎癥因子，造成細(xì)胞炎癥以及組織損傷[14]。目前科學(xué)家通過研究證實(shí)，小鼠通過IRAK-1基因敲除技術(shù)進(jìn)行研究顯示，其發(fā)生膿毒血癥以及腦脊髓炎的幾率能夠顯著降低，證明在小鼠體內(nèi)IRAK1低水平表達(dá)，是防止炎癥進(jìn)一步放大的防護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制[15-16]。但miR-146a-5p是否對(duì)HepG2細(xì)胞中IRAK-1因子表達(dá)水平產(chǎn)生抑制作用目前尚未見報(bào)道，本研究顯示miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白水平顯著低于對(duì)照組，說明miR-146a-5p在蛋白水平對(duì)IRAK-1進(jìn)行調(diào)節(jié)，能夠通過降低IRAK-1水平抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，如患者循環(huán)中miR-146a-5p表達(dá)水平發(fā)生變化，其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相應(yīng)發(fā)生變化，可通過檢測(cè)miR-146a-5p直接檢測(cè)體內(nèi)炎癥反應(yīng)變化情況。

miR-9-3p是一類參與代謝過程的miRNA，目前研究報(bào)道在機(jī)體的葡萄糖及脂類代謝過程中發(fā)揮作用。ABCA1膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子[17]。研究報(bào)道，如將巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平顯著下調(diào)，能夠?qū)е录?xì)胞膽固醇外流水平顯著下降[18-19]，使膽固醇水平升高，脂質(zhì)代謝紊亂。報(bào)道顯示，在apoE受體基因敲除的小鼠中，其巨噬細(xì)胞中所表達(dá)的ABCA1顯著下調(diào)，小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的幾率顯著增加，并且程度是較重的 [20]。因此研究糖脂代謝相關(guān)miR-9-3p與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ABCA1之間表達(dá)水平的關(guān)系，能夠從基因?qū)用嫔钊腙U述糖尿病患者發(fā)生膽固醇代謝紊亂其調(diào)節(jié)異常的真正原因。本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-3p轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞ABCA1蛋白水平顯著低于對(duì)照組，提示miR-9-3p通過蛋白水平參與ABCA1基因的表達(dá)調(diào)控，高水平的miR-9-3p能夠?qū)е履懝檀即x紊亂，可通過檢測(cè)循環(huán)中miR-9-3p水平反應(yīng)體內(nèi)膽固醇代謝情況。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-146a-5p能夠抑制細(xì)胞炎癥因子IRAK-1蛋白表達(dá)，miR-9-3p抑制細(xì)胞脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子ABCA1蛋白表達(dá)，為miRNA相關(guān)炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)調(diào)節(jié)的機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 "參考文獻(xiàn)

[1] Lai KP， Huang CK， Fang LY， et al.Insulin resistance and adiposity correlate with acute-phase reaction and soluble cell adhesion molecules in type 2 diabetes[J]. A Therosclerosis，2003，166 （2）：387-394.

[2] Hu FB， Meigs JB， Li TY， et al. Inflammatory markers and risk of developing type 2 diabetes in women[J]. Diabetes，2004，53 （3） ： 693-700.

[3] Spranger J，Kroke A，Mohl IGM，et al. Inflammatory cytokines and the risk to develop type 2 diabetes： results of the prospective population based European prospective investigation into cancer and nutrition （EPIC）-pots dam study[J]. Diabetes，2003，52（3）： 812-817.

[4] Balasubramanyam M，Aravind S，Gokulakrishnan K，et al. Impaired miR-146a-5p expression links subclinical inflammation and insulin resistance in Type 2 diabetes[J]. Mol Cell Biochem，2011，351（1-2）：197-205.

[5] Chen X，Liang H，Zhang J，et al. Horizontal transfer of microRNAs： Molecular mechanisms and clinical applications[J]. Protein Cell，2012，3（1）： 28-37.

[6] Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes[J]. Circ Res，2010，107（6）： 810-817.

[7] Pescador N，Pérez-Barba M，Ibarra JM，et al.Serum circulating microRNA profiling for identification of potential type 2 diabetes and obesity biomarkers[J]. PLoS One，2013，8（10）： 251.

[8] Joh EH，Jeong JJ，Kim DH.Kalopanaxsaponin B inhibits LPS-induced inflammation by inhibiting IRAK1 Kinase[J].Cell Immunol，2012，279（1）：103-108.

[9] Yang WS，Jeong "D，Yi "YS，et al.Myrsineseguiniiethanolicextract and its active component quercetin inhibit macrophage activation and peritonitis induced by LPS by targeting to Syk/Src/IRAK-1[J].Ethnopharmacol，2014，151（3）：1165-1174.

[10] Chen X， Liang H， Zhang J， et al. Secreted microRNAs：A new form of intercellular communication[J].Trends Cell Biol，2012，22（3）：125-132.

[11] Duan X， Zhan Q，Song B，et al.Detection of platelet microRNA expression in patients with diabetes mellitus with or without ischemic stroke[J].J Diabetes Complications， 2014，28（5）：705-710.

[12] Taganov KD， Boldin MP， Chang KJ， et al. NF-kappa-B-dependent induction of microRNA miR-146， an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J]. Proc Nat AcadSci，2006，103：12481-12486.

[13] Xie YF， Shu R，Jiang SY， et al. MicroRNA-146 inhibits pro-inflammatory cytokine secretion through IL-1 receptor-associated kinase 1in human gingival fibroblasts[J].J Inflamm （Lond），2013，10（1）：20.

[14] Steer S A， Scar IM A L， Cham Bers KT， et al. Interleukin-1 stimulates beta-cell necrosis and release of the immunological adjuvant HMGB1[J]. PLoS Med，2006，3（2）： 17.

[15] Janssens S，Beyaert R.Functional diversity and regulation of different interleukin-1 receptor-associated kinase （IRAK） family members[J].Mol Cell，2003，11（2）：293-302.

[16] Deng C，Radu C，Diab A，et al.IL-1 receptor-associated kinase 1 regulates susceptibility to organ-specific autoimmunity[J]. Immunol，2003，170（6）：2833-2842.

[17] Schmitz G，Buechler C.ABCA1：Regulation， trafficking and association with heteromeric proteins[J]. Ann Med， 2002，34：334-347.

[18] Haghpassand M， Bourassa PA， Francone OL. et al. Monocyte/maeroPhage expre ssion of ABCA1 has minimal contribution to Plasma HDL leveIs[J].Clin Invest，2001， 108：1315-1320.

[19] Van Eck M. Leukocyte ABCA1controls susceptibility to atherosc-lerosis and maeroPhage recruitment into tissues[J]. Aead，2002，99：6298-6303.

[20] Vaisman BL，Lambert G，Amar M，et al.ABCA1 overexpression leads to hyperalphalipoproteinemia and increased biliary cholesterol excretion in transgenic-mice[J]. Clinical Investigation ，2001，108（2）：303-309.

[2022-12-15收稿]