芳樟葉萃取物對(duì)種植物致病真菌的抑制試驗(yàn)

黃達(dá)龍.芳樟葉萃取物對(duì)5種植物致病真菌的抑制試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)，2023，17（23）：94-96，99.

摘 要 為探明芳樟葉萃取物對(duì)植物致病真菌的抑制效果，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了芳樟葉乙酸乙酯和乙醇萃取物對(duì)蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、鏈孢粘帚霉菌（Gliocladium catenulatum）等5種植物病原真菌的抑菌活性。研究表明，芳樟葉的乙酸乙酯和乙醇萃取物對(duì)參試植物病原真菌均有不同程度的抑菌效果，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果顯著優(yōu)于乙醇萃取物（p＜0.05）；2 mg·mL-1乙酸乙酯萃取物對(duì)蘋果黑腐皮殼菌和鏈孢粘帚霉菌的抑制率均在60%以上。選擇乙酸乙酯萃取物對(duì)蘋果黑腐皮殼菌和鏈孢粘帚霉菌進(jìn)行毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈孢粘帚霉菌的抑菌效果最好，其EC50為0.996 mg·mL-1。

關(guān)鍵詞 芳樟葉萃取物；植物病原菌；抑菌活性；毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S759.82 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.23.020

收稿日期：2023-09-12

基金項(xiàng)目：中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目“香樟精油提取技術(shù)推廣示范”（閩〔2020〕TG07號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：黃達(dá)龍（1970—），男，福建南安人，大專，林業(yè)工程師，從事森林培育。E-mail：nalyyl@126.com。

樟（Camphora officinarum Nees）屬樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠大喬木，根據(jù)揮發(fā)油主要成分的不同，可以分為以芳樟醇為主的芳樟、以樟腦為主的本樟和以松油醇為主的油樟3個(gè)類型[1-2]。我國(guó)芳樟資源較為豐富，在福建省大部分地區(qū)均有大面積種植，可以作為香料、中醫(yī)藥、化工產(chǎn)品等產(chǎn)品的成分來(lái)源[3-4]。目前，關(guān)于芳樟的研究方向主要包括揮發(fā)油成分和活性等，對(duì)非油部分的化學(xué)成分和活性報(bào)道較少。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芳樟主要含有黃酮、木脂素、苯丙素類、萜類等化合物，且具有較好的抑菌活性，尤其是對(duì)于真菌病害[5-8]。

蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）是一種能夠引起蘋果樹腐爛病的致病真菌，主要通過(guò)侵害蘋果的枝干使蘋果樹皮發(fā)生腐爛，侵染果實(shí)使其產(chǎn)量和品質(zhì)下降，其分布廣泛，危害嚴(yán)重[9-10]。鏈孢粘帚霉菌（Gliocladium catenulatum）是豌豆根腐病的一種致病真菌，能侵襲三葉草和衰弱的豆類植物組織[11-12]。

本試驗(yàn)以芳樟葉為材料，通過(guò)不同溶劑進(jìn)行萃取并利用得到的萃取物對(duì)常見植物致病菌進(jìn)行抑菌活性研究，為豐富芳樟資源多樣化利用以及植物源農(nóng)藥的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試劑與儀器

甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等，均為分析純，購(gòu)自浙江杭宇醫(yī)藥科技有限公司。

YJ-1300型雙人單面凈化工作臺(tái)，深圳市三莉科技有限公司生產(chǎn)；LDZF-30KB型高壓滅菌鍋，西安禾普生物科技有限公司生產(chǎn)；PR224ZH/E型電子分析天平，深圳市怡華新電子有限公司生產(chǎn)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州博匯精密科技有限公司生產(chǎn)；HH系列-1型電熱恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所生產(chǎn)；DL-3020低溫冷卻液循環(huán)泵，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2" 植物材料和供試菌株

芳樟葉為2019年7月采自福建省安溪半林國(guó)有林場(chǎng)（位于北緯24°56′55″、東經(jīng)117°59′36″，海拔727.8 m）的三年生芳樟，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全研究員鑒定為樟科樟屬芳樟（Cinnamomum camphora var. linaloolifera），品系為“牡丹1號(hào)”；枝葉標(biāo)本（No.20190715）保存于福建農(nóng)林大學(xué)自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心樣品室。采集后的芳樟葉陰干，粉碎后備用。

供試菌種為水稻紋枯菌（Thanatephorus cucumeris）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、西瓜尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、蘋果黑腐皮殼菌、鏈孢粘帚霉菌，由福建農(nóng)林大學(xué)教育部生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3" 提取分離

取芳樟葉干燥粗粉10 kg，加入50 L的75%乙醇，80 ℃回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，得浸膏2 kg。稱取2份1.5 kg浸膏與等量硅藻土拌樣，分別用40 L乙酸乙酯和乙醇加熱回流萃取2次，每次2 h，得到乙酸乙酯萃取物350 g和乙醇萃取物550 g備用。

1.4" 芳樟葉萃取物抑菌活性實(shí)驗(yàn)

分別稱取2.0 g芳樟葉乙醇萃取物和乙酸乙酯萃取物，分別用甲醇溶解并定容到20 mL，得到

100 mg·mL-1的溶液，將得到的兩種萃取物溶液分別加入已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基中制成濃度為2.0 mg·mL-1的加藥培養(yǎng)基。對(duì)照組中加入等體積的甲醇，設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行接種培養(yǎng)。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定芳樟葉乙醇萃取物和乙酸乙酯萃取物5種供試植物致病真菌的抑制活性，利用公式（1）計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[13-15]。

式中：[η]為菌絲生長(zhǎng)抑制率，%；[D1]為對(duì)照菌落直徑，cm；[D2]為處理菌落直徑，cm。

1.5" 芳樟葉萃取物毒力測(cè)定

萃取物用75%乙醇進(jìn)行溶解，并加入PDA培養(yǎng)基中配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·mL-1梯度含藥培養(yǎng)基，對(duì)照組中加入等體積的75%乙醇，設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行接種培養(yǎng)，培養(yǎng)6～8 d，并利用軟件計(jì)算毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.6" 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 26.0和Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 芳樟葉粗提物抑菌活性篩選

如圖1所示，芳樟葉乙酸乙酯和乙醇萃取物對(duì)5種植物致病真菌均有一定的抑制效果。乙酸乙酯萃取物對(duì)植物致病真菌的抑制效果顯著優(yōu)于乙醇萃取物（p＜0.05）。乙酸乙酯萃取物對(duì)5種植物致病真菌均具有較好的抑菌活性，其中對(duì)蘋果黑腐皮殼菌（V）和鏈孢粘帚霉菌（G-1）的抑菌作用最強(qiáng)。芳樟葉乙醇萃取物對(duì)這5種植物致病真菌的抑制率均在25%以上，其中對(duì)鏈孢粘帚霉病菌（G-1）的抑制率最高，為42.57%，但遠(yuǎn)低于乙酸乙酯萃取物的作用效果。

2.2" 芳樟葉乙酸乙酯萃取物的毒力測(cè)定結(jié)果

芳樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)蘋果黑腐皮殼菌（V）和鏈孢粘帚霉菌（G-1）的抑菌作用最強(qiáng)，因此選取這兩種菌進(jìn)行毒力實(shí)驗(yàn)，以萃取物濃度（x）為自變量，以死亡率或抑制率（y）為因變量，利用SPSS 26.0軟件擬合相應(yīng)的毒力回歸方程。如表1、圖2所示，隨著芳樟葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加，對(duì)鏈孢粘帚霉病菌及蘋果黑腐皮殼菌抑制效果增強(qiáng)，菌落直徑明顯變小，其中對(duì)鏈孢粘帚霉病菌的抑制效果最佳，EC50值為0.996 mg·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.975；對(duì)蘋果黑腐皮殼菌的作用的EC50值為1.478 mg·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.964。

3" 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用菌絲生長(zhǎng)速率法，探討了芳樟葉不同萃取物對(duì)5種常見植物致病菌的抑菌活性，旨在為植物源農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，芳樟葉萃取物對(duì)選取的5種植物致病真菌均具有抑制效果，不同溶劑得到的萃取物對(duì)植物致病真菌的抑制效果也具有明顯的差異；芳樟葉乙酸乙酯萃取物的抑制效果顯著強(qiáng)于乙醇萃取物（p＜0.05）；芳樟葉乙酸乙酯萃取物在濃度為2 mg·mL-1時(shí)對(duì)蘋果黑腐皮殼菌和鏈孢粘帚霉菌的抑制率均在60%以上，說(shuō)明芳樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)蘋果黑腐皮殼菌和鏈孢粘帚霉菌這兩種病菌均具有較好的抑制作用，可為開發(fā)防治植物病害產(chǎn)品提供新思路。利用SPSS 26.0軟件擬合出相應(yīng)的毒力回歸方程分析數(shù)據(jù)，得出芳樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈孢粘帚霉菌的EC50值為0.996 mg·mL-1，可為由鏈孢粘帚霉菌引起的病害的防治提供理論依據(jù)。

芳樟是一種使用范圍較廣的植物，在我國(guó)資源較為豐富，具有葉片生物量大、全年可采、揮發(fā)油含量高等優(yōu)點(diǎn)，是提取芳樟精油的優(yōu)質(zhì)原料。在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中，芳樟葉的用途僅限于精油生產(chǎn)，隨后作為燃料焚燒，植物利用率低，導(dǎo)致資源浪費(fèi)嚴(yán)重。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芳樟葉萃取物具有較好的抑制植物病原真菌活性，將有效拓寬芳樟葉資源利用思路，為芳樟葉萃取物開發(fā)植物源殺菌劑提供數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]" 黃祚驊，鄒嘉偉，周文娟，等.香樟葉提取物對(duì)植物病原菌的生物活性研究[J].林業(yè)勘察設(shè)計(jì)，2021，41（2）：29-32.

[2]" 吳美婷，劉詩(shī)瑤，黃達(dá)龍，等.芳樟葉的化學(xué)成分及其抗炎活性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2021，46（14）：3592-3598.

[3]" 杜永華，敖光輝，魏琴，等.脫油油樟葉化學(xué)成分預(yù)試及其總黃酮含量測(cè)定[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（10）：120-123.

[4]" 杜永華，敖光輝，魏琴，等.油樟葉總黃酮和總多糖的抑菌活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：408-410.

[5]" 王智慧，凌鐵軍，張梁，等.樟樹葉化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（6）：860-863.

[6]" 杜永華，敖光輝，魏琴，等.油樟葉總黃酮的提取及體外抗自由基活性[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（20）：32-36.

[7]" 杜永華，敖光輝，魏琴，等.油樟葉總黃酮含量測(cè)定及其抗油脂氧化活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：308-311.

[8]" 敖光輝，杜永華，魏琴，等.油樟葉多糖抗油脂氧化作用的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（7）：14-17.

[9]" 靳紀(jì)洋，刁雨菲，于成明，等.蘋果黑腐皮殼菌侵染蘋果枝干過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組分析[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，52（2）：187-193.

[10]" 張?bào)谢蓿狼?，錢信怡，等.香樟化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2019，40（10）：320-333.

[11]" 胡文杰，羅輝，戴彩華.油樟葉的化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2019，34（11）：140-146.

[12]" 侯思雯.甘肅高寒陰濕地區(qū)蠶豆苗期根腐病的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[13]" LI Y R， FU C S， YANG W J， et al. Investigation of constituents from Cinnamomum camphora （L.） J. Presl and evaluation of their anti-inflammatory properties in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages[J].Journal of Ethnopharmacology，2018（221）：37-47.

[14]" 張?jiān)轮?金絲草水溶性部位抗真菌活性成分研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2018.

[15]" KHAN M， WANG R B， LI B J， et al. Comparative Evaluation of the LAMP Assay and PCR-Based Assays for the Rapid Detection of Alternaria solani[J].Frontiers in microbiology，2018（9）：1-11.

（責(zé)任編輯：張春雨" 丁志祥）