基于網絡藥理學與GEO 基因芯片探討四君子湯與痛瀉要方“同病異治”腹瀉型腸易激綜合征的作用機制

于官正，李 鴻，涂 星

(1.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000)

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant-irritable bowel syndrome，IBS-D）是一種以腹痛、腹瀉為主要臨床特征的腸道功能紊亂性疾病，發病機制尚未明確，可能與腸上皮屏障通透性升高、內臟高敏感性、腦-腸軸功能失調等相關[1]。臨床治療IBS-D 常使用解痙、止瀉等藥品，療效單一且價格昂貴[2]。中醫認為IBS-D 屬于“腹瀉”“下利”等范疇，基本病機為脾失健運、肝郁脾虛等，常采用益氣健脾、疏肝健脾等方法進行治療[3]。四君子湯與痛瀉要方為治療IBS-D 的經典方，四君子湯以人參為君藥，偏于益氣健脾，痛瀉要方以白術為君藥，偏于燥濕止瀉，體現了“同病異治”的中醫特色，但其治療IBS-D 的共性機制尚不明確[4]。網絡藥理學從整體上分析中藥復方多成分、多靶點、多通路的調節機制，與中醫整體觀念與辨證論治思想相契合，為中醫學“同病異治”的觀點的闡述提供有效途徑[5，6]。本研究通過網絡藥理學預測四君子湯與痛瀉要方治療IBS-D 潛在共性靶點與通路，擬探究兩復方“同病異治”IBS-D 的潛在共性機制，以期為臨床治療IBS-D 用藥提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 軟件及數據庫 Cytoscape（3.7.2）；Java（1.8.0）；Perl 語言（Active Perl 5.30）；R 語言（x64 4.2.1）；Bioconductor 平 臺（https://www.bioconductor.org，version3.15）；中藥系統藥理分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/index.php，version2.3）；Gene Expression Omnibus 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO 數據庫）；STRING 數據庫（http://string-db.org/，version 11.5）。各數據庫的檢索均于2022 年12 月12 日完成。

1.2 篩選疾病差異基因 于GEO 數據庫中輸入diarrhea-predominant irritable bowel syndrome normal，物種選擇“Homo sapiens”進行搜索，IBS-D 基因載于GSE6701 芯片，該芯片數據由77 個健康受試者和53 個IBS-D 患者基因表達量構成[7]。下載該芯片的平臺文件與探針文件。借助Perl 語言將探針名稱轉化為基因名稱并進行分組。以健康組和IBS-D 組基因差異倍數的絕對值（|logFC|）≥1 且p＜0.05 為標準，運用R 語言分析基因數據的差異性，篩選疾病差異基因并繪制火山圖。

1.3 預測復方活性成分及靶點 于TCMSP 數據庫中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥0.30、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為條件進行檢索[8，9]，獲取四君子湯與痛瀉要方的活性成分及對應靶點。運用Perl 語言進行藥物靶點ID 轉化，將靶點名轉為對應的基因名。

1.4 構建中藥復方調控網絡 將1.3 獲得的兩復方作用靶點基因與IBS-D 差異基因繪制Venn 圖，取交集；運用Perl 語言呈現出交集基因對應的活性成分；運用Cytoscape 軟件繪制中藥復方調控網絡并進行拓撲分析[10]。

1.5 PPI 網絡分析 將1.4 得到的交集基因錄入STRING 數據庫，選擇“Multiple proteins”，物種選擇“Homo sapiens”，將游離蛋白點隱藏后更新構建PPI網絡，通過R 語言運行腳本及PPI 網絡TSV 文件，按照基因富集數目由多至少為條件篩選排名前30的基因為核心基因并繪制圖片。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 通過R 語言中RSQLitec 插件與org.He.eg.db（version3.15）數據包對基因進行編碼，再運用colorspace、stringi 插件和 DOSE、clusterProfiler、pathview 數據包（version3.15），以p＜0.05 為條件進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO 富集分析根據值由小到大篩選每個板塊排名前10 的條目，不足10 條則分析全部，p值越小，結果越顯著；KEGG 富集分析同GO 分析條件，分析排名前20 的通路。

2 結果

2.1 篩選疾病差異基因 運行R 語言以|logFC|≥1 且p＜0.05 為標準，對GSE6701 芯片所載數據進行篩選，得到健康組與IBS-D 組差異基因2642 個，上調基因與下調基因分別為1033、1609 個，見圖1。

圖1 差異表達基因火山圖

2.2 預測復方活性成分及靶點 于TCMSP 數據庫中，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件對四君子湯與痛瀉要方所有成分進行篩選，得到四君子湯活性成分136 個，對應靶點229 個；痛瀉要方活性成分43 個，對應靶點129 個。

2.3 構建中藥復方調控網絡 運行Perl 語言進行藥物靶點ID 轉化，將剔重后的四君子湯與痛瀉要方活性成分作用靶點基因與IBS-D 差異基因繪制Venn圖，取交集。四君子湯、痛瀉要方與IBS-D 交集基因分別為33、26 個，兩復方作用靶點基因與IBS-D 差異基因的交集基因共36 個；包含23 個共性基因，10個四君子湯優勢交集基因；3 個痛瀉要方優勢交集基因，見圖2。運用Perl 語言呈現出交集基因的活性成分，運用Cytoscape 軟件繪制中藥復方調控網絡圖，得到310 條邊（表示復方活性成分與疾病靶點基因之間的相互作用），144 個結點（表示四君子湯與痛瀉要方活性成分和疾病靶點基因），見圖3。

圖2 四君子湯、痛瀉要方作用靶點基因與IBS-D 差異基因Venn 圖

圖3 四君子湯與痛瀉要方調控網絡

2.4 PPI 網絡分析 將2.3 所得的36 個交集基因錄入STRING 數據庫，構建PPI 網絡。通過R 語言根據基因富集數目篩選排名前30 的基因為核心基因，繪制圖片，見圖4。

圖4 PPI 蛋白互作網絡與PPI 網絡核心基因

2.5 GO 通路富集分析 運行R 語言設置p＜0.05 對痛瀉要方與IBS-D 交集基因進行GO 富集分析，獲得功能條目273 條，包含BP 243 條，CC 8 條，MF 22條，涉及脂多糖反應、活性氧反應、營養水平反應、質膜穴樣內陷、G 蛋白偶聯胺受體活性、羧酸結合、單羧酸結合等生物功能；同法分析四君子湯與IBS-D交集靶點，獲得功能條目385 條，其中BP 345 條，CC 1 條，MF 39 條，涉及調節激素水平、脂多糖反應、營養水平反應、質膜穴樣內陷、G 蛋白偶聯胺受體活性、羧酸結合、單羧酸結合等生物功能，見圖5。其中，脂多糖反應、營養水平反應、質膜穴樣內陷、G蛋白偶聯胺受體活性、羧酸結合、單羧酸結合等為兩復方治療IBS-D 潛在共性生物學事件。

圖5 痛瀉要方及四君子湯GO 富集功能分析條形圖

2.6 KEGG 通路富集分析 運行R 語言以p＜0.05 為條件對四君子湯與IBS-D 交集基因進行KEGG 富集分析，共得到功能條目64 條，涉及脂質與動脈粥樣硬化、膀胱癌、化學致癌作用-受體激活、AGERAGE 等信號通路；同法分析痛瀉要方與IBS-D 交集靶點，共得到KEGG 功能條目54 條，涉及化學致癌作用-受體激活、脂質與動脈粥樣硬化、類固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路，見圖6。涉及化學致癌作用-受體激活、脂質與動脈粥樣硬化、AGERAGE 等信號通路為兩復方治療IBS-D 潛在共性調控信號通路。

圖6 四君子湯與痛瀉要方KEGG 富集分析氣泡圖

3 討論

近年來，隨著生活環境的改變及心理壓力增加，IBS-D 在我國發病率呈上升趨勢，給患者及社會醫療行業帶來沉重壓力[11]。中醫辨證論治IBS-D獨具優勢，認為肝郁脾虛證、脾虛濕盛證等為IBS-D的主要證型，其中以肝郁脾虛證最為多見。四君子湯與痛瀉要方是治療IBS-D 的經典方，四君子湯始載于宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術、茯苓、炙甘草組成，具有補中益氣、健脾和胃之功，善治脾虛濕盛證[12]。痛瀉要方始載于《景岳全書》，由炒白術、炒白芍、陳皮、防風組成，具有疏肝健脾、止痛止瀉之功，善治肝郁脾虛證[13]。雖有大量文獻對四君子湯及痛瀉要方單獨治療IBS-D 的機制進行研究，但對二者“同病異治”發揮作用的共性機制鮮有報道。

本研究在網絡藥理學基礎上篩選出四君子湯與痛瀉要方活性成分及對應靶點，其中可作用于IBS-D 的靶點分別有33、26 個，共36 個，包括23 個共性靶點，這與中藥復方干預疾病具有多成分、多靶點的特性相吻合[14]。同時，本研究發現四君子湯可通過脂質與動脈粥樣硬化、膀胱癌、AGE-RAGE 等信號通路來調節激素水平、脂多糖反應、質膜穴樣內陷、單羧酸結合等生物功能發揮治療IBS-D 的作用；痛瀉要方可通過化學致癌作用-受體激活、類固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路調節脂多糖反應、活性氧反應、營養水平反應、G 蛋白偶聯胺受體活性、單羧酸結合等生物功能發揮抗IBS-D 的作用，這與中藥復方多通路治病的特征一致[15]。近年來有研究發現[16，17]，IBS-D 的發病與腦腸互動失衡紊亂、免疫功能失常、內臟敏感性升高、腸道菌群失衡及腸道黏膜屏障損傷等因素密切相關，表明可從調節免疫功能、保護粘膜屏障、改變腸道運動等方面來改善IBS-D，為其臨床治療提供了新思路。有文獻報道[18，19]，四君子湯可以通過改善腸道運動功能、保護腸道黏膜屏障、調節腸道菌群、干預細胞增殖及凋亡等發揮抗IBS-D 的作用，與本研究挖掘出的四君子湯抗IBS-D 主要生物學功能和通路相符。痛瀉要方治療IBS-D 涉及腸道病理生理多個方面。本研究結果顯示，其治療IBS-D 所涉及的通路中，腸道感覺功能及炎癥反應發揮了主要作用，還可以適當調節精神心理。痛瀉要方的有效成分可通過多通路及功能來降低內臟敏感性、改善腸道運動等。同時，IBS-D患者多表現為焦慮、抑郁，中醫稱之為肝氣郁結，肝郁脾虛。研究發現[20]，IBS-D 肝郁脾虛者多存在腦腸互動紊亂，痛瀉要方可調暢情志、條達肝氣，調節腦腸肽來恢復腦腸互動、胃腸功能，降低內臟敏感性，保護腸黏膜屏障，發揮治療IBS-D 的作用，與本研究預測出的痛瀉要方治療IBS-D 所涉及的主要生物學功能和通路相符。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學與GEO 數據庫挖掘發現調控化學致癌作用-受體激活、脂質與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 等信號通路及脂多糖反應、營養水平反應、質膜穴樣內陷、G 蛋白偶聯胺受體活性、羧酸結合、單羧酸結合等生物功能可能為四君子湯與痛瀉要方治療IBS-D 潛在共性生物學事件。本研究尚有不足之處，未開展相關動物實驗進行驗證，后期需開展更多實驗驗證。