miRNA 在動脈粥樣硬化中調控血管平滑肌細胞的研究進展

馮 登，程 鵬，王 毅，鄭江華

(1.川北醫學院臨床醫學系，四川 南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院血管外科，四川 南充 637000)

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以動脈壁炎癥介質和免疫激活為特征的慢性免疫炎癥性疾病，由不同趨化因子與各種血管細胞和非血管細胞相互作用導致AS 病變[1]。這些細胞包括血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）、巨噬細胞（macrophage，M?）、內皮細胞（endothelial cells，ECs）等。AS 中VSMCs 作為血管的重要組成部分，其涉及的生理病理過程，包括細胞增殖、遷移、自噬、凋亡、鈣化、衰老和表型轉換等，影響AS 的形成及發展。在轉錄水平或轉錄后水平調控AS 相關基因的表達，有助于緩解AS 的進展。因此，了解miRNA 在AS 發生和發展中調控VSMCs 的作用機制至關重要。本文對miRNA 進行概述，并對miRNA 在VSMCs 功能調節中的作用及其臨床應用作一綜述，以期為AS 相關疾病的預防及治療提供思路。

1 miRNA 概述

miRNA 是一類大約含有22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA，其前體具有發夾或折疊的二級結構，負責轉錄后基因調控[2]。因miRNA 與靶基因具有互補性，miRNA 可以通過互補配對結合到基因的mRNA的3′UTR，從而抑制該基因翻譯。此外，miRNA 也可以通過靶向mRNA 的5′UTR 和CDS 區來調節靶基因的表達[3]。植物中miRNA 與靶基因幾乎以完全互補配對的方式結合，然而動物中的miRNA 和靶mRNA 并不完全互補，但是靶點至少有7 個堿基與miRNA 5′端互補，才能調控其靶基因[4]。當兩者完全互補時，可以導致靶mRNA 降解。不完全互補時，miRNA 則主要通過與靶mRNA 的3′UTR 結合，阻遏轉錄后翻譯。據估計[5]，miRNA 調節大約1/3 的蛋白質編碼基因的表達，它們既被視為表觀遺傳學變化（如DNA 甲基化）的靶點，也被視為表觀遺傳學修飾因子（如DNA 甲基轉移酶）的調節器。通常一個miRNA 可以調控多個基因的表達，幾個miRNA 的組合也可以用來精細調控某個基因的表達，從而構成體內復雜的miRNA 調控網絡。雖然miRNA 已知在AS 中表達，但其在與AS 相關疾病中的作用尚未完全明確。因此，深入針對miRNA 的研究有助于開發更準確的診斷和預后循環生物標志物，以及提供針對不同階段AS 的治療策略。

2 miRNA 在VSMCs 功能調節中的作用

2.1 miRNA 調控VSMCs 增殖與遷移 VSMCs 主要分布在動脈的中層，通過一層彈力板與內膜隔開，但也有少量平滑肌細胞分布在內膜。AS 病變部位的VSMCs 主要是從中膜遷移而來。VSMCs 的增殖和遷移既是機體對損傷的修復反應，也是AS 發生發展的主要病理基礎。Li ML 等[6]研究發現，miR-362-3p的上調通過抑制血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶1（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-1，ADAMTS1）的表達，抑制了VSMCs 的增殖和遷移。胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors 2，IGF-2）是一種具有復雜調節模式的生長因子，其活性部分受差異表達的IGF-2 受體和IGF 結合蛋白的調節，miR-637 通過下調IGF-2抑制VSMCs 的增殖和遷移，從而影響AS 的進展[7]。神經纖毛蛋白-2（neuropilin 2，NRP2）是一種非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，miR-377-3p 通過靶向NRP2 抑制AS 模型中VSMCs 的增殖和遷移[8]。Ghasempour G 等[9]研究表明，miR-181b 和miR-204 通過趨化因子（chemokine）信號通路下調造血細胞激酶（hematopoietic cell kinase，HCK），進而抑制了VSMCs的增殖和遷移。miR-125a 通過靶向HMG-CoA 還原酶（HMGCR）調節甲羥戊酸（mevalonate）信號通路抑制VSMCs 增殖和遷移[10]。此外，還有一些miRNA 可促進VSMCs 的增殖和遷移。miR-93 首次被證明能靶向線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）促進VSMCs 增殖和遷移，其調控過程是通過抑制Raf-ERK1/2 信號通路實現的[11]。miR-378a-5p 是通過靶向CDK1/p21 信號通路促進VSMCs 增殖和遷移的關鍵介質[12]。Kruppel 樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）是一種鋅指蛋白轉錄因子，microRNA-92a 通過抑制其表達，從而調控ROCK/MLCK 信號通路促進VSMCs 增殖和遷移[13]。miR-320a 通過靶向抑制G 蛋白調節信號蛋白5（RGS5）促進VSMCs 增殖和遷移，從而加重AS[14]。Kang XL 等[15]研究發現，miR-3646 通過靶向RHOH 促進VSMCs 的增殖和遷移。Sun B 等研究證明[16]，miR-186-5p 的上調促進VSMCs增殖和遷移，還發現AS 患者血清miR-186-5p 水平與頸動脈內膜中層厚度（CIMT）呈正相關。因此，它可能是AS 的診斷生物標志物。

2.2 miRNA 調控VSMCs 表型轉化 在正常生理情況下，VSMCs 保持靜止狀態，通過維持血管壁張力和完整性在血管內環境穩定中發揮著重要作用。在細胞外刺激或環境影響下，VSMCs 表現出表型可塑性，即可以從收縮/非增殖表型轉換為遷移/增殖表型。VSMCs 的表型可塑性是由特定標記物的表達來定義的，如平滑肌肌動蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈、轉膠蛋白和鈣調蛋白等[17]。Farina FM 等[18]研究報道，miR-128-3p 是一種新的表型開關調節器，能調控VSMCs 的遷移、增殖、分化和收縮性，而KLF4 是miR-128-3p 的直接靶點，能夠調節關鍵VSMCs基因肌球蛋白重鏈11（MYH11）的甲基化狀態。Yan SR 等[19]研究證實，在AS 中miR-338-3p 表達升高，而升高的miR-338-3p 抑制結蛋白的表達，從而促進收縮型VSMCs 向合成型VSMCs 的表型轉變。除了形態學改變外，miR-338-3p 還增強了VSMCs 的增殖能力，但不增強其移動能力。總之，miR-338-3p 促進了AS 的發展。miR-17-5p 通過下調同源盒基因B13（HOXB13）抑制血小板衍生因子（PDGF-BB）刺激的表型調節VSMCs，表明這些因素可能是內膜增生的潛在治療靶點[20]。miR-33a 介導磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt/mTOR）通路促進VSMCs 表型轉化,加速AS 的發生和發展[21]。Zhuang XJ 等[22]實驗證明，miR-146b-3p通過靶向磷脂酰肌醇-3 激酶催化亞基γ（PIK3CG）抑制PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉換。miR-145靶向VSMCs 上表達的趨化因子C-C-基元受體2（CCR2），促進收縮性VSMCs 表型，并減少AS 中的不穩定斑塊[23]。miR-4463 通過靶向堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）直接或間接激活c-jun 氨基末端激酶（JNK）和細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路，最終促進VSMCs 表型轉換[24]。

2.3 miRNA 調控VSMCs 凋亡與自噬 細胞程序性死亡包括凋亡及自噬，是不同于細胞壞死的一種死亡方式,是由生物本身基因決定的細胞主動而有序的死亡方式。VSMCs 凋亡是由促炎性細胞因子、氧化低密度脂蛋白、高水平一氧化氮和機械損傷誘導的，其特征在于VSMCs 細胞質殘留物周圍的基底層增厚。通常情況下，VSMCs 可以通過自噬來維持細胞自身結構和功能的穩定，但在被各種刺激過度激活后導致AS 的加速發展，如活性氧和脂質種類、細胞因子、生長因子和代謝應激[25]。Cui RR 等[26]研究發現，miR-494 通過下調BCL2 樣蛋白11（BCL2L11）的表達抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導的VSMCs凋亡。

ROBO4 是神經元Robo 家族的主要同系物，之前被認為是一種關鍵的血管特異性受體，在血管內皮中特異表達并抑制ECs 遷移。miR-140-5p 通過靶向抑制AS 中的血管內皮調節蛋白（ROBO4）基因表達從而抑制VSMCs 凋亡[27]。TGFBR1 是一種膜結合蛋白，屬于TGFBR 亞家族，MiR-665 通過靶向轉化生長因子β 受體1（TGFBR1）促進VSMCs 的凋亡[28]。Bao Q 等[29]研究發現，miR-210 靶向抑制VSMCs 中的肌細胞增強因子2C（MEF2C）來抑制凋亡。miR-4787-5p 通過靶向蛋白激酶D1（PKD1）和抑制PI3K/Akt/FKHR 通路促進VSMCs 凋亡[30]。Wang WR 等[31]研究顯示，抑制miR-145 表達促進了轉化生長因子-β1（TGF-β1）刺激的VSMCs 的自噬。植物源性Sal-miR-58 通過調節Krüppel 樣因子3/E3 泛素連接酶/磷酸果糖激酶（KLF3/NEDD4L/PFKP）途徑促進VSMCs 自噬并減輕炎癥[32]。Liang X等[33]研究發現，miR-4487 通過靶向抑制RASA1 進而抑制VSMCs 凋亡。

2.4 miRNA 調控VSMCs 衰老 AS 是一種衰老疾病，其發病率和患病率隨年齡增長而增加。衰老見于構成AS 斑塊的所有細胞，尤其是VSMCs，可促進AS及其斑塊的不穩定。衰老的標志包括細胞衰老、DNA 損傷（包括端粒磨損）、線粒體功能障礙、促炎性分泌表型、蛋白質穩定缺陷、表觀遺傳變化、營養傳感失調和祖細胞衰竭[34]。Chen YL 等[35]研究結果表明，miR-214 通過靶向RNA 結合蛋白（quaking）從而促進VSMCs 衰老，其機制可能與端粒完整性受損和VSMCs 細胞周期停滯有關，這意味著miR-214可能是血管衰老的標志物和血管疾病的潛在治療靶點。SDC1 是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的關鍵成員之一，miR-665 抑制通過負向調節多配體蛋白聚糖-1（SDC1）發揮VSMCs 衰老的重要調節作用，此外，miR-665 通過與lncRNA GAS5 相互作用調節VSMCs 衰老[36]。自噬相關蛋白（Beclin1）是一種與自噬密切相關的因子，當自噬發生時，它會顯著上調，Tan P 等[37]研究證實，miR-30a 直接下調Beclin1 促進VSMCs 的衰老。

2.5 miRNA 調控VSMCs 鈣化 鈣化是羥基磷灰石礦物質在動脈壁的沉積，發生在動脈內膜和中層。內膜鈣化與動脈閉塞和AS 斑塊破裂有關，其主要驅動因素是炎癥、氧化應激、細胞凋亡和中層鈣化。雖然最初被認為是一個被動過程，但內膜和中層的鈣化是一個主動且受嚴格調控的過程，主要由VSMCs驅動[38]。He L 等[39]研究結果表明，在高磷誘導的血管鈣化過程中，miR-103a 通過抑制成骨特異性轉錄因子（Runx2）減輕血管鈣化，這是治療這種病理現象的潛在新靶點。miR-223-3p 通過阻斷白細胞介素-6/信號傳導蛋白和轉錄激活物3（IL-6/STAT3）信號抑制血管鈣化[40]。miR32-5p 通過靶向含FYVE 指磷酸肌醇激酶（PIKfyve）上調微環境中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α），促進VSMCs 鈣化[41]。在高鈣/高磷條件下，miR155 通過抑制雷帕霉素靶蛋白復合物2（Rictor/mTORC2）抑制Akt 的激活，導致叉頭框蛋白O 亞族3a（FOXO3a）磷酸化和降解降低，FOXO3a 在細胞核內的積累激活了促凋亡蛋白（如Bim）的轉錄，從而增強VSMCs 凋亡。凋亡的VSMCs 隨后促進血管鈣化[42]。組蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）是Ⅱ類組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的成員，miR-134-5p通過抑制VSMCs 中的HDAC5 誘導鈣化[43]。Zhang F等[44]研究表明，miR-140-5p 通過靶向Toll 樣受體（TLR4）抑制β-甘油磷酸誘導的VSMCs 鈣化，為血管鈣化提供了一種潛在的治療方法。

3 miRNA 應用

miRNA 是一系列疾病狀態中潛在的診斷或預后標志物。因為循環中的miRNA 可以在外周血、唾液和尿液中檢測到，其表達可能是AS 疾病各個階段的先兆。將多個miRNA 組合在一個miRNA 圖譜中可能比單個microRNA 圖譜的評估更準確。因此，為了確定miRNA 作為AS 相關疾病生物標記物的作用，開展大規模研究至關重要。脂質體、聚合物膠束和基于脂蛋白的藥物載體等藥物遞送載體正在開發中，以將這些寡核苷酸遞送至細胞。Wang J 等[45]基于兩親性三嵌段共聚物（PCEC）材料，通過自愈封裝工藝開發了一種miR-22 洗脫心血管支架，在最佳劑量下，miR-22 的持續釋放在不干擾ECs 增殖和功能的情況下顯著增強了VSMCs 的收縮表型并抑制其增殖，從而顯著導致抑制支架內狹窄。Izuhara M 等[46]研究證實，含miR-126（納米顆粒）NPs 通過抑制（胰島素受體底物1）IRS-1 減少VSMCs 的增殖和遷移，然后制備了含miR-126 復合（聚乳酸-羥基乙酸共聚物）PLGA NPs 涂層裸金屬支架，在兔再狹窄模型中，這種輸送系統對新生內膜的形成有明顯的抑制作用。

4 總結

miRNA 可以通過靶基因及信號通路調控VSMCs 功能，從而促進或抑制AS。但由于miRNA 通常針對同一調控網絡中的多個基因，了解特定miRNA靶點的完整性以及了解miRNA 途徑中干擾因素至關重要。miRNA 靶向基因網絡的能力不僅為通過調節基因通路治療疾病提供了獨特的方法，另一方面還可了解其他靶基因的潛在有害影響，因此如何避免潛在有害影響也是未來研究的關鍵問題。相信隨著對VSMCs 功能調控的研究，針對AS 相關疾病的miRNA 靶向治療具有廣闊前景。