甲型流感病毒基質蛋白M1的研究進展

孫藝學，叢彥龍

(1.長春大學 吉林省生物醫學工程研發中心，吉林 長春 130022；2.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)屬于正黏病毒科、α流感病毒屬，是感染各種鳥類和多種哺乳動物的病原體。IAV基因組由8條分節段的、單股負鏈RNA組成，編碼至少17種蛋白[1]。其中，基質蛋白1(matrix protein 1，M1)是IAV第7基因節段所編碼、294個氨基酸組成，且是病毒粒子內含量最高的結構蛋白，約占病毒蛋白總量的40%[2]。每個病毒粒子約含有3 000個M1分子[3]，緊挨在病毒囊膜下層形成一層基質。但M1并不是孤立存在的，其向外與IAV的兩種跨膜纖突蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，NA)的胞質尾區結合[4]，向內與病毒的8個核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein，vRNP)互作[5]。M1不僅保持了病毒粒子的完整性，維持并調節病毒粒子的形態，而且在病毒生命周期的不同階段發揮著多種功能[6-7]。

1 M1的結構

在負染電鏡下，M1是長約60?的桿狀物，其與病毒囊膜接觸，但沒有嵌入膜內[8]。高分辨率冷凍電子斷層掃描顯微鏡顯示，M1為空心圓柱體，類似一串螺旋盤升的“珠子”[9]。X射線分析顯示，約90%的M1的二級結構由α-螺旋組成，具體包括3個結構域，即由4個α-螺旋(H1～H4)構成的氨基端結構域(殘基1～66)，由4個α-螺旋(H6～H9)構成的中間結構域(殘基88～158)，以及預測的同樣由4個α-螺旋(H10～H13)構成的羧基端結構域(殘基167～252)。其中，氨基端結構域和中間結構域位于M1的N-末端，二者由L4-H5-L5連接，即所謂的“連接區”(殘基67～87)[2]。中間結構域和位于C-末端的羧基端結構域由一個環區L9(殘基162～166)連接，其間保守的163RQMV166基序具有Q-M裂解位點[10]。

2 M1在IAV復制周期中的功能

M1合成于IAV感染的晚期，在病毒生命周期中的脫殼、vRNP出核、病毒組裝和出芽等多個階段均發揮作用。

2.1 介導vRNP的釋放IAV進入細胞后需要將vRNP釋放到細胞質以開啟病毒的復制周期，而拆除基質層M1的骨架結構(即病毒的脫殼)是vRNP釋放的前提條件。三維結構分析表明，IAV的8段vRNP的排列方式是基于M1骨架結構的支撐[11]，但這種支撐作用在病毒復制周期中的不同階段時有時無。在pH6.0左右時，基質層的構象開始發生變化，使M1與vRNP的互作弱化，導致病毒粒子的剛性喪失[12]，此時是病毒脫殼的啟動階段。當pH值下降至4.9時，M1骨架解體，不再靠近病毒囊膜，此時vRNP出現非對稱性定位，M1與vRNP形成一個聚集體，并促使vRNP進入細胞質[9]。由此可見，M1與vRNP的互作與pH的改變有關。進一步研究發現，在pH 6.5～7.0和5.0～5.5時，M1的電荷數明顯不同，由此導致病毒的結構發生明顯變化[13]。

2.2 介導新組裝的vRNP出核研究發現，當M1的合成受阻時，vRNP的出核將受到抑制[14]，表明M1是子代vRNP出核的必需蛋白，同時也暗示新合成的M1需要入核才能幫助vRNP出核。研究顯示，在M1的多功能基序(殘基91～105)中，有富含堿性氨基酸的經典核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，位于殘基101RKLKR105。在空間構象上，NLS位于M1的N-末端結構的表面，在α-螺旋H6和H7之間形成一個暴露的環。NLS是M1入核的關鍵因素，缺失NLS的M1不能入核[15]。新合成的M1在入核后，位于M1轉錄抑制區中的殘基R/K95、K98和K102可以與vRNP互作[16]，調節vRNP中RNA聚合酶的活性，從而適時阻止vRNA的轉錄，以利于vRNP的順利出核。但是，新合成的M1并非全部入核，留在細胞質中的部分M1能夠阻止已經出核的vRNP再次入核[14]。

2.3 介導病毒的裝配和出芽M1被稱為IAV組裝的“適配器”。作為樞紐，M1通過與病毒的其他蛋白協同作用以誘導細胞質膜彎曲，再通過與NP的互作將vRNP整合到出芽部位。M1與細胞質膜結合和M1的寡聚化是病毒粒子組裝過程中兩個密切相關的過程。當M1單體(或二聚體)與質膜結合后，會觸發M1在質膜下重排形成螺旋狀的寡聚體，并暴露出另一側以便與未結合的M1分子互作[9]。結合到質膜上的M1通過與HA、NA和/或M2的胞質尾區互作，從而誘導質膜彎曲，此即病毒的出芽位置。作為招募vRNP的停靠點，與質膜結合的M1通過其C-末端與vRNP中的NP蛋白結合，由此將vRNP運送至質膜處。在此，vRNP被選擇性地裝配到出芽的病毒粒子中[17]。

3 M1對IAV生物學表型的影響

3.1 維持病毒形態M1在出芽病毒粒子的囊膜下形成一層基質，為病毒囊膜提供剛性支撐。多項研究表明，M1是維持和調節IAV形態表型的決定性遺傳因素[18]。例如，將以絲狀表型為主的2009年新甲型H1N1流感病毒的M1基因替換到A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)中，可以使PR8由球形變為絲狀[19]。此外，M1的氨基酸殘基突變也可以影響病毒粒子的形態表型。例如，N30D和T215A突變會使A/Duck/Guangxi/53/2002(H5N1)由球狀變為絲狀。K102A突變的A/WSN/1933(H1N1)(WSN)可以形成絲狀粒子，而K95A、K98A、R101A、K102A的協同突變則可使WSN的形狀和大小各異，并且其形態表型會隨溫度改變[20]。R95K和E204D突變會降低A/Udorn/307/1972(H3N2)的絲狀表型[21]。將PR8經豚鼠反復傳代后，它的M1逐漸出現87，92，101，157等位點的累積突變，最終使PR8由球形變為絲狀[22]。但是，某些M1位點變異會導致病毒粒子出芽異常，由此釋放出更長的病毒粒子[23]。進一步研究發現，在IAV組裝時，不同的M1螺旋轉角也會影響病毒的形態[9]。

3.2 影響病毒的復制研究顯示，M1能夠通過自身的代償性突變修復基因缺失病毒的復制力。例如，缺失NS1的WSN經過連續傳代后發生M1/A14U變異，盡管M1的mRNA水平受到影響，但是病毒的其他蛋白表達水平均不受影響。NINPAN等[24]研究發現，A/ostrich/Zimbabwe/222-E3/1996(H7N1)的NP蛋白在A549細胞中存在出核缺陷，但是NP的297位和M1的227位在傳至第10代的協同突變可以挽救病毒的復制缺陷。此外，M1的翻譯后修飾也影響病毒的復制。研究發現，M1/242K的SUMO化在M1-vRNP復合體形成，vRNP出核、轉運、裝配，以及病毒的出芽過程中均發揮重要作用。當M1發生K242E突變時，M1與vRNP的結合能力降低，影響M1-vRNP復合體的形成和vRNP的出核，從而阻礙病毒的復制[25]。M1還可以發生磷酸化修飾。M1的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基可以被蛋白激酶C和細胞外信號調節蛋白激酶磷酸化[26]。磷酸化位點在M1入核和病毒復制中的作用至關重要。去除M1第132位的磷酸化，會損害M1與importin-α1的結合，從而因M1的入核受阻導致病毒的復制力下降[27]。

3.3 影響病毒的毒力M1是IAV毒力的基礎。例如，A/Port Chalmers/1/73、A/FPV/34、PR8和WSN在適應小鼠的過程中，M1的A41V突變能夠增強病毒對小鼠的致病力。FAN等[28]發現，2株鴨源H5N1病毒均能致死雞，但只有1株對小鼠具有致病力。究其原因，發現M1的30和215位是影響H5N1病毒毒力的重要氨基酸位點。

3.4 影響病毒的傳播能力M1影響病毒傳播能力的證據基于2009年新甲型H1N1流感病毒。當將A/California/4/2009的M1基因替換到PR8時，能夠恢復PR8在豚鼠的傳播能力。二者的差別在于PR8的M1第41位編碼V，而A/California/4/2009的M1編碼A[19]。后經研究發現，M1/41位是IAV有效傳播的重要位點[29]。由于M1/41位不僅影響病毒的形態，還與傳播能力有關，據此推測病毒的形態與其傳播能力有關。一般認為，天然的絲狀表型更有利于病毒的傳播[30]。

4 小結與展望

作為一種多功能蛋白質，M1在病毒復制過程中發揮著重要作用。與暴露在IAV表面的兩種糖蛋白HA和NA相比，IAV的內部蛋白進化速度較慢，其中M1是進化最慢的蛋白之一。對全球不同物種來源的、不同亞型IAV的序列分析顯示，M1氨基酸的序列一致性超過95%[31]。較低的變異頻率可能是由于M1受到的選擇壓力強度較低，因此沒有必要經常“變臉”。而更可能的原因是，M1的多功能角色使其對變異做出了自我約束，當然也可能是因為其自身承受不了過多的突變。此外，M1殘基的低突變耐受性也反映了其位點在病毒感染周期中的重要作用。作為豐度最高的IAV蛋白，M1的低突變耐受性暗示它在維持病毒結構與功能方面所發揮的作用不容小覷。從M1蛋白的適應性著手，開展以M1各個變異表型功能為導向的分子基礎研究，有望成為解析IAV物種適應性差異和流行優勢更迭的切入點。

此外，序列的高度保守性使M1成為一個理想的廣譜抗病毒靶點。據推測，通過一個小分子“楔形物”與M1-M1界面緊密結合，以此破壞M1的寡聚化，將產生一類全新的抗流感藥物。為了證明其可行性，KORDYUKOVA等[13]對一個超過70 000種的商用小分子庫進行了虛擬篩選，結果發現了有進一步研究價值的M1的“楔形物”抑制劑。生物物理學研究表明，一些抑制劑確實能夠通過與M1結合，由此削弱M1-M1的自締合作用，進而降低了成熟病毒粒子中基質層的厚度，導致季節性H1N1、大流行性H1N1、H3N2和H5N1等多株流感病毒在雞胚中的復制受到抑制。因此，M1有望成為一個全新的抗流感廣譜藥物的理想靶點。