低氧環境下菊苣酸對SD大鼠心肌組織低氧適應性的影響

劉嘉華，吳 華，行倩文，劉 波，張龍飛，王夢杰，陳鑫磊，王文勝

(青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016)

高海拔地區自然環境特殊，空氣中氧氣含量隨著海拔高度的升高而降低，一般認為海拔3 000 m以上的地區為低氧環境。當機體受到低氧刺激時，體內氧化與抗氧化系統失衡，氧化中間產物如活性氧(ROS)等大量產生，導致脂質過氧化、線粒體功能損傷、細胞凋亡等，進而威脅機體生命活動健康[1-2]。心臟是對缺氧反應敏感的器官之一，增強心臟的功能及低氧適應能力，可為高海拔低氧地區動物機體生命活動的維持提供更有利的保障。因此，開發有效的增強動物心肌低氧適應能力的飼料添加劑顯得極為重要。

菊苣酸(chicoric acid,CA)又稱二咖啡酰酒石酸，是一種咖啡酸類衍生物，主要存在于紫錐菊等植物中，是一種天然的免疫活性成分。眾多研究表明，CA具有增強免疫、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[3-4]。SCHLERNITZAUER等[5]研究證明，CA是一種有效的ROS清除劑，可通過減少氧化應激條件下的ROS積累，發揮抗氧化損傷作用。蔡坤玲等[6]研究表明，CA可促進超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，起到抗氧化作用。WU等[7]研究表明，低氧環境下CA可促進牦牛心肌組織HIF-1α、EPO、VEGF等低氧適應基因的表達，增強高寒地區牦牛的低氧適應性。本課題組前期研究表明，低氧環境下CA可通過作用于SD大鼠血液學指標，增強SD大鼠對高海拔低氧環境的適應能力[8]。然而，目前關于CA對低氧環境下SD大鼠心肌組織低氧適應性的研究鮮見報道?；诖?，本試驗擬以SD大鼠為研究對象，于低氧環境下對SD大鼠灌胃不同濃度CA，明確CA對SD大鼠心肌組織低氧適應性的影響。擬為解析CA對SD大鼠心肌組織低氧適應潛在的影響作用及緩解高海拔地區動物低氧應激提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料60只6～8周齡、體質量為(192.00±7.35) g的健康雄性SD大鼠(P<0.05)，購自青海喜馬拉雅動物實驗中心有限公司(動物許可證號：SCXK(陜)2018-001)，于青海省河南蒙古族自治縣畜牧獸醫工作站(海拔3 500 m，氧濃度13.65%[9])進行飼養。紫錐菊提取物——CA購自西安銳博生物科技有限公司。成分：CA含量4%，其中CA(2.0%～2.2%)+咖啡酸(1.0%～1.5%)+綠原酸(0.5%～1.0%)+紫錐菊甙(0.3%～0.5%)，為黃綠色精細粉末。

1.2 主要試劑SD大鼠飼料、試驗用楊木刨花墊料均購自江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；0.9%氯化鈉注射液購自石家莊四藥有限公司；4%多聚甲醛購自Biosharp生物公司；水合氯醛購自上海展云化工有限公司；ROS測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、SOD測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒、CAT測定試劑盒、超微量Na+K+-ATP酶測試盒、超微量Ca2+-ATP酶測試盒、總蛋白(TP)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司；HIF-1α、VEGF、EPO引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、SuperReal彩色熒光定量預混試劑盒均購自天根生化科技有限公司；HIF-1α、VEGF、EPO抗體、辣根過氧化酶(HRP)標記山羊抗兔IgG、牛血清白蛋白(BSA)、蘇木素染液、DAB顯色劑均購自賽維爾生物科技有限公司。

1.3 低氧環境下SD大鼠飼養試驗將60只SD大鼠于室溫(21±2 )℃(試驗時間：2021.06.06-2021.08.08)進行飼養。適應性喂養2周后將SD大鼠隨機分為對照組、不同劑量CA組(10，20，40 mg/kg)，每組15只。每天上午9:00對SD大鼠進行灌胃，對照組SD大鼠灌胃0.5 mL生理鹽水，試驗組SD大鼠分別灌胃10，20，40 mg/kg劑量的CA，并每天稱體質量，4組SD大鼠飼喂基礎飼糧條件一致，連續灌胃49 d后進行試驗。基礎飼糧組成：谷物類原材料占比80%，包含玉米、次粉、小麥、苜蓿草、豆粕；動物性蛋白占比10%，包含秘魯魚粉、美國雞肉粉；預混料占比10%，包含動物預混料、谷朊粉、碳酸氫鈣、石粉、色拉油、飼料級氯化鈉、飼料級氯化鎂。其營養水平見表1。

表1 營養水平(干物質基礎) %

1.4 試驗樣品采集試驗第50 天早上9:00，將4組SD大鼠空腹稱體質量，并每組分別隨機抽取3只，用10%水合氯醛腹腔麻醉后取出SD大鼠心臟，將心臟表面血液用生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干后置于液氮中保存待檢。

1.5 SD大鼠心肌組織ROS活性測定按試劑盒說明書制備SD大鼠心肌組織單細胞懸液，使用DCFH-DA熒光探針，采用熒光酶標儀在激發波長和發射波長分別為500，525 nm處檢測各組SD大鼠心肌組織中ROS的活性。

1.6 SD大鼠心肌組織抗氧化指標測定取出SD大鼠心肌組織樣品自然解凍后，在提前預冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙擦干，稱取0.1 ～0.2 g于研缽中，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰浴條件下，制備成10%的組織勻漿。按前述處理制備各組SD大鼠心肌組織勻漿，隨后分別按照試劑盒說明書分別采用TBA法于532 nm處檢測 MDA 含量，WST-1法于450 nm 處檢測 SOD 活性，比色法于412 nm處檢測GSH-Px活性，鉬酸銨法于405 nm處檢測CAT含量，考馬斯亮藍法檢測組織蛋白濃度。

1.7 SD大鼠心肌線粒體功能相關指標測定稱取約0.1 g SD大鼠心肌組織，加入1.0 mL提取液，用研缽于冰上勻漿。4℃、600×g離心10 min。將上清液移至另一離心管中，4℃、 11 000×g離心15 min。在上清及沉淀中分別加入 1.0，0.4 mL提取液，超聲波破碎，用于復合體Ⅰ、Ⅲ活性測定，并且用于蛋白含量測定。然后采用比色法，按照試劑盒說明書進行各組SD大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性的檢測。

1.8 SD大鼠心肌能量代謝相關指標測定準確稱取SD大鼠心肌組織質量，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清(即10%的勻漿上清液)，再用生理鹽水10倍稀釋成1%，同時用考馬斯亮藍法檢測組織蛋白濃度。隨后按照試劑盒說明書進行處理，通過定磷法檢測各組SD大鼠心肌組織 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性。

1.9 SD大鼠心肌組織低氧適應基因mRNA及蛋白表達測定

1.9.1qRT-PCR檢測SD大鼠心肌組織低氧適應基因的mRNA表達 取-80℃凍存的SD大鼠心肌組織，用TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑盒分別提取各組大鼠心肌組織總RNA并進行RNA完整性及濃度檢測，隨后按照cDNA反轉錄試劑盒操作說明書將RNA反轉錄為cDNA，最后采用SYBR PrimescriptTM試劑盒進行定量PCR分析。試驗每組3個重復，根據公式2-△△Ct計算所測基因的相對表達量。

表2 引物信息

1.9.2免疫組化法檢測SD大鼠心肌組織低氧適應基因的蛋白表達 大鼠心肌組織切片脫蠟至水，微波爐中火8 min至沸，停火8 min保溫再轉中低火7 min 修復抗原，3%雙氧水溶液室溫孵育25 min消除內源性過氧化物酶活性，滴加3% BSA 封閉30 min，分別滴加HIF-1α(1∶200)、EPO(1∶900) 和VEGF(1∶100) 抗體，4℃孵育過夜，滴加二抗室溫孵育50 min，滴加 DAB 顯色劑顯色，復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對陽性表達產物進行平均光密度值分析。

1.10 數據分析試驗數據采用統計軟件 SPSS 21.0 進行統計分析，采用One-Way ANOVA單因素方差分析方法進行分析，Duncan's法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，采用GraphPad Prism 8.0繪圖軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織ROS活性的影響由圖1可知，與對照組相比，10 mg/kg組顯著降低ROS活性(P<0.05)，20，40 mg/kg組極顯著降低ROS活性(P<0.01)。試驗組間結果顯示，與10 mg/kg組相比，40 mg/kg組極顯著降低ROS活性(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組顯著降低ROS活性(P<0.05)。其余組間差異不顯著(P>0.05)。

*P<0.05,**P<0.01

2.2 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織抗氧化指標的影響由圖2可知，與對照組相比，40 mg/kg組顯著降低MDA含量(P<0.05)。試驗組間結果顯示，40 mg/kg組顯著降低MDA含量(P<0.05)(圖2A)。與對照組相比，20 mg/kg組顯著提高SOD活性(P<0.05)，40 mg/kg組極顯著提高SOD活性(P<0.01)。試驗組間結果顯示，40 mg/kg組顯著提高SOD活性(P<0.05)(圖2B)。與對照組相比，20，40 mg/kg組極顯著提高GSH-Px活性(P<0.01)；試驗組間結果顯示，與10 mg/kg組相比，20，40 mg/kg組極顯著提高GSH-Px活性(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組顯著提高GSH-Px活性(P<0.05)(圖2C)。與對照組相比，20，40 mg/kg 組極顯著提高CAT活性(P<0.01)。試驗組間結果顯示，20 mg/kg組顯著提高CAT活性(P<0.05)，40 mg/kg組極顯著提高CAT活性(P<0.01)。其余組間差異不顯著(P>0.05)(圖2D)。

A.MDA含量的變化；B.SOD活性的變化；C.GSH-Px活性的變化；D.CAT活性的變化。*P<0.05,**P<0.01

2.3 低氧環境下CA對SD大鼠心肌線粒體功能相關指標的影響結果顯示，與對照組相比，10 mg/kg組顯著提高呼吸鏈復合體Ⅰ活性(P<0.05)，20，40 mg/kg組極顯著提高呼吸鏈復合體Ⅰ活性(P<0.01)，試驗組間差異不顯著(P>0.05)(圖3A)。與對照組相比，不同劑量CA組極顯著提高呼吸鏈復合體Ⅲ活性(P<0.01)；試驗組間結果顯示，20，40 mg/kg 組極顯著提高呼吸鏈復合體Ⅲ活性(P<0.01)。其余組間差異不顯著(P>0.05)(圖3B)。

A.心肌線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性的變化；B.心肌線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ活性的變化。*P<0.05,**P<0.01

2.4 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織能量代謝相關指標的影響結果顯示，與對照組相比，40 mg/kg 組極顯著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)。試驗組間結果顯示，與10 mg/kg組相比，40 mg/kg組極顯著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組顯著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.05)(圖4A)。與對照組相比，20，40 mg/kg組顯著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。試驗組間結果顯示，20，40 mg/kg組顯著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。其余組間差異不顯著(P>0.05)(圖4B)。

A.Na+K+-ATP酶活性的變化；B.Ca2+-ATP 酶活性的變化。*P<0.05,**P<0.01

2.5 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織低氧適應基因mRNA及蛋白表達的影響

2.5.1低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織低氧適應基因mRNA表達的影響 結果顯示，與對照組相比，20，40 mg/kg組極顯著促進HIF-1α的mRNA表達(P<0.01)。試驗組間結果顯示，20，40 mg/kg組極顯著促進HIF-1α的mRNA表達(P<0.01)(圖5A)。與對照組相比，不同劑量CA組極顯著促進EPO的mRNA表達(P<0.01)。試驗組間結果顯示，與 10 mg/kg組相比，40 mg/kg組極顯著促進EPO的mRNA表達(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組顯著促進EPO的mRNA表達(P<0.05)(圖5B)。與對照組相比，10，20 mg/kg組顯著促進VEGF的mRNA表達(P<0.05)， 40 mg/kg組極顯著促進VEGF的mRNA表達(P<0.01)。其余組間差異不顯著(P>0.05)(圖5C)。

A.HIF-1α基因的mRNA表達情況；B.EPO基因的mRNA表達情況；C.VEGF基因的mRNA表達情況。*P<0.05,**P<0.01

2.5.2低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織低氧適應基因蛋白表達的影響 由圖6A結果可知，HIF-1α陽性表達的細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒，EPO陽性表達的細胞質中出現棕黃色顆粒，VEGF陽性表達的細胞膜或細胞漿中出現棕黃色顆粒。與對照組相比，20 mg/kg組顯著促進HIF-1α的蛋白表達(P<0.05)，40 mg/kg組極顯著促進HIF-1α的蛋白表達(P<0.01)；試驗組間結果顯示，40 mg/kg組顯著促進HIF-1α的蛋白表達(P<0.05)。與對照組相比，20，40 mg/kg組極顯著促進EPO的蛋白表達(P<0.01)；試驗組間結果顯示，40 mg/kg組顯著促進EPO的蛋白表達(P<0.05)。與對照組相比，10 mg/kg組極顯著促進VEGF的蛋白表達(P<0.01)，20，40 mg/kg組顯著促進VEGF的蛋白表達(P<0.05)。其余組間差異不顯著(P>0.05)(圖6B)。

A.HIF-1α、EPO、VEGF的陽性表達情況；B.HIF-1α、EPO、VEGF的平均光密度值。*P<0.05,**P<0.01

3 討論

3.1 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織ROS活性的影響ROS是機體內一類氧的單電子還原物，包括H2O2、O2-等，可參與血管內皮細胞通透性的調節過程[10]。一定量的ROS有利于機體的自身調節，正常環境下，ROS產生后會被相應的自由基清除劑清除，使其在機體內保持穩定的狀態。當機體受到低氧等刺激時，組織器官中ROS產生過多導致自由基清除劑不能完全清除而使其大量蓄積，從而引起脂質過氧化、線粒體功能損傷等[11-12]。本研究結果表明，與對照組相比，10 mg/kg組ROS活性顯著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg組ROS活性極顯著降低(P<0.01)。試驗組間結果表明，40 mg/kg組ROS活性顯著降低(P<0.05)。表明低氧可能引起SD大鼠心肌組織ROS過量產生，導致心肌損傷，而CA可通過降低ROS活性起到緩解心肌損傷的作用，且40 mg/kg組作用效果最好。

3.2 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織抗氧化指標的影響MDA是脂質過氧化反應的終產物，具有細胞毒性，其含量變化不僅能反映ROS生成量還能間接反映機體低氧損傷的程度[2]。有研究表明，機體發生氧化應激時血清MDA含量升高[13]。SOD是生物體系中抗氧化酶系的主要成員之一，是機體內重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，可清除體內多余的ROS，拮抗因ROS大量升高對機體造成的損傷[14]。GSH-Px、CAT是機體中廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，亦是反映機體抗氧化能力的關鍵指標，具有清除ROS的作用[15-16]。本研究結果表明，與對照組相比，低氧環境下不同劑量CA組顯著降低MDA活性(P<0.05)，20，40 mg/kg組顯著提高SOD、GSH-Px、CAT活性(P<0.05)。試驗組間結果表明，40 mg/kg組顯著降低MDA含量(P<0.05)，顯著提高SOD活性(P<0.05)，極顯著提高GSH-Px、CAT活性(P<0.01)。說明低氧可能引起ROS過量產生進而導致SD大鼠心肌組織脂質過氧化損傷，而CA可通過增強SD大鼠心肌組織抗氧化能力，減弱脂質過氧化程度及ROS活性，增強SD大鼠心肌組織的低氧適應能力，且40 mg/kg 組作用最佳。

3.3 低氧環境下CA對SD大鼠心肌線粒體功能相關指標的影響線粒體是組織細胞內氧化磷酸化和ATP產生的主要場所，是心肌細胞最重要的細胞器，在維持心肌正常生命活動方面具有重要作用。線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ是ROS產生的主要部位，長期低氧引起機體內多種抗氧化機制破壞，ROS生成增加導致線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性降低，從而影響線粒體功能[17]。王延玲[18]研究證明，3 400 m 的高海拔環境下應用藥物美托洛爾后能通過提高大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合體活性來減弱ROS產生，緩解低氧損傷。程巖巖等[19]研究證明，中藥健脾化痰祛瘀方能增加心肌線粒體呼吸鏈復合體活性，維持氧化磷酸化的功能，保護心臟。本研究結果表明，與對照組相比，低氧環境下不同濃度CA均可顯著提高心肌線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性(P<0.05)。試驗組間結果表明，20，40 mg/kg組極顯著提高呼吸鏈復合體Ⅲ活性(P<0.01)，40 mg/kg 組活性最高。揭示低氧可能引起ROS過量產生進而導致SD大鼠心肌線粒體功能障礙，而CA可通過促進線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性抑制ROS產生，改善SD大鼠心肌線粒體功能，增強SD大鼠的低氧適應。

3.4 低氧環境下CA對SD大鼠心肌能量代謝相關指標的影響ATP酶主要存在于組織細胞膜及細胞器膜上，是生物膜上的關鍵蛋白酶。其功能主要是催化ATP水解為ADP和磷酸，并釋放能量滿足機體生命活動所需[20]。ATP酶主要有Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶。Na+-K+-ATP酶主要表達于細胞膜，Ca2+-ATP酶在細胞膜和肌漿網均有表達。心肌缺氧時，ATP生成迅速減少，鈉泵活性降低，慢鈉通道増加，導致細胞內鈉離子增多。同時，Ca2+-ATP酶活性受到抑制，使心肌細胞內外鈣離子失衡，最終導致心肌損傷。因此，保持Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性能更好的維持細胞內Na+、Ca2+濃度的穩定，在低氧下起到增強心肌適應性的作用[21-23]。本試驗結果表明，與對照組相比，低氧環境下40 mg/kg組極顯著提高Na+-K+-ATP酶活性(P<0.01)，20，40 mg/kg組顯著提高Ca2+-ATP酶活性(P<0.05)。試驗組間結果表明，40 mg/kg 組極顯著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)，20，40 mg/kg組顯著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。闡明低氧可能引起SD大鼠心肌組織能量代謝障礙，而CA可通過提高SD大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，維持心肌內外離子平衡，改善能量代謝，增強心肌組織的低氧適應性，且40 mg/kg組作用效果最佳。

3.5 低氧環境下CA對SD大鼠心肌組織低氧適應基因mRNA及蛋白表達的影響HIF-1α對機體缺氧具有敏感的特異性，對維持體內氧氣穩態具有重要的作用。EPO基因是最早發現的與低氧適應相關的基因，可通過促進紅細胞生成調節血液攜氧能力，緩解機體缺氧情況。有研究表明，當機體供氧不足時，EPO基因的表達量顯著增加[24]。VEGF在機體血管生成和血管重塑中起重要作用，VEGF可作用于血管內皮細胞，使缺氧組織周圍的血管新生，從而改善組織缺氧損傷情況[25]。EPO和VEGF是HIF-1α的標志性靶基因，在缺氧環境下，HIF-1α通過促進EPO、VEGF的轉錄與表達，從而促進紅細胞生成，提高組織攜氧能力，增加血管的新生能力，減少組織缺氧造成的損傷，從而對心肌缺氧起到代償的保護作用[26-27]。本試驗結果表明，與對照組相比，低氧環境下CA可顯著促進低氧適應基因HIF-1α、EPO、VEGF的mRNA及蛋白表達(P<0.05)。試驗組間結果顯示，40 mg/kg組極顯著促進HIF-1α、EPO的mRNA表達(P<0.01)，顯著促進HIF-1α、EPO的蛋白表達(P<0.05)。說明CA可通過作用于HIF-1α來調控EPO及VEGF的表達，提高組織攜氧能力及血管新生能力，進而增強動物機體低氧條件下的生存能力，且40 mg/kg組作用最好。

綜上所述，CA可通過抑制SD大鼠心肌組織ROS活性，提高其抗氧化能力、線粒體功能、能量代謝水平及低氧適應能力，增強SD大鼠心肌組織低氧適應性，且以40 mg/kg組作用最佳。為解析CA對SD大鼠心肌組織低氧適應潛在的影響作用及緩解高海拔地區動物低氧應激提供新思路。