甘草多糖緩解妊娠期暴露代森錳鋅致仔鼠腎臟損傷的保護作用

孫雨昕，溫 冉，宮英闌，包佳鷺，張偉偉，趙俊芳，王曉丹,3*

(1.河北農業大學 中獸醫學院，河北 保定 071000；2.河北象大合眾生物科技有限公司，河北 正定 050800;3.河北省獸醫生物技術創新中心，河北 保定 071000)

代森錳鋅(mancozeb，MCZ)屬于二硫代氨基甲酸乙二醇酯(EBDC)類農藥，是一種乙烯-二硫代氨基甲酸錳和鋅鹽的混合物，因其低毒性、短期環境持久性的特點[1]，自1948年以來一直在多種農作物、觀賞植物上作為常用的廣譜殺菌劑使用[2]。MCZ因其殺菌譜廣、作用位點多、無抗藥性、能為植物補充微量元素鋅的特性，從而提高農作物的免疫力，改善農作物的品質，因此被廣泛用于防治蔬菜和果樹等作物中真菌引起的多種病害[3]。然而MCZ及其代謝產物乙撐硫脲[4]可以在對人體有致畸、致癌、影響胚胎著床[5]作用，又在土壤中持久存在，在水中迅速分解，具有高危害潛力，引起了外界的關注。

近年來，對在實驗動物中產生的MCZ毒性的研究表明，MCZ的EBDC部分導致大鼠肝臟和腎臟中谷胱甘肽狀態和必需金屬銅穩態改變[6]。有研究發現MCZ對實驗動物的毒性與生殖毒性、神經毒性、內分泌干擾[7]以及睡眠障礙[8]等有關，對人類也有一定的致癌性[9]。國內有研究表明，甘草多糖(Glycyrrhizapolysaccharide，GP)對于緩解MCZ毒性的效果較好[10]，如誘導細胞生成活性氧(ROS)[11]，增強雞免疫球蛋白IgA和IgG水平[12]、減少肝臟中IL-1β和IFN-γ的升高[13]等提高毒性抵抗力。在MCZ帶來的潛在危害中，農業和工業工人是發生MCZ中毒的高風險人群，對一般人群也有一定危害性。為此，本試驗初步探索妊娠期暴露MCZ對其子代45日齡仔鼠腎臟損傷及GP對妊娠期暴露MCZ誘導子代小鼠腎臟損傷的影響，為人類及動物的健康成長提供相應的幫助，為中藥的治療作用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MCZ(商品級Dithane-M45，80%)、GP(30%)購自西安圣青生物科技有限公司； EastepTMSuper 總RNA 提取試劑盒(LS1040)購自Promega公司；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R323-01)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自 TaKaRa公司 (RR820A)；總蛋白定量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)、鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1)、轉化生長因子β1(TGF-β1)試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 實驗動物分組及處理方法分別選用50只雌性、10只雄性7周齡SPF級昆明小鼠，購自斯貝福實驗動物科技有限公司，常規雌、雄分籠飼養，自由飲水，1周后合籠飼養。發現雌鼠陰栓當日定為孕0 d 并換籠單獨飼養。將50只孕鼠隨機分為空白對照組(K組)、MCZ對照組(M組)、GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組，每組10只。空白對照組早晚各灌服1次0.1 mL生理鹽水；MCZ對照組每天早上灌服150 mg/kg的MCZ，晚上灌服0.1 mL生理鹽水；GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組早上灌服150 mg/kg的MCZ、晚上分別灌服50，100，200 mg/kg的GP，所有孕鼠單獨喂養，產后與仔鼠同窩喂養，仔鼠21 d時斷奶，泌乳期不飼喂母鼠MCZ。本試驗動物處理過程通過河北農業大學實驗動物倫理委員會的動物倫理學審查。

1.3 指標測定

1.3.1仔鼠體質量及腎臟指數測定 稱取45日齡仔鼠體質量，斷頸處死后摘取腎臟組織，記錄不同組仔鼠腎臟質量。腎臟指數=腎臟質量(g)/體質量(g)×100%。

1.3.2仔鼠腎臟組織形態觀察 將仔鼠腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規制備石蠟切片，厚度為5 μm，常規HE染色后于光學顯微鏡下觀察仔鼠腎臟組織形態變化。

1.3.3仔鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量測定 仔鼠血液3 000 r/min離心，取上清，分裝，-20℃ 保存待測。取上清液分別用BUN、Cr試劑盒測定仔鼠血清中BUN和Cr含量。

1.3.4仔鼠腎臟組織勻漿中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量測定 取仔鼠腎臟按試劑盒說明書制備10%組織勻漿，提取其上清液，分裝，-20℃保存待測。取組織勻漿上清液，按照說明書分別用T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA試劑盒測定腎臟組織中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.3.5仔鼠腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1含量測定 取仔鼠腎臟按ELISA試劑盒說明書制備10%組織勻漿，提取其上清液，分裝，-20℃保存待測。取10%組織勻漿上清液，按照說明書分別用ELISA試劑盒測定腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1的含量。

1.3.6仔鼠腎臟組織中GPX4、NADPH氧化酶4(NOX4)、核轉錄因子NF-κB(NF-κB)p65 mRNA轉錄水平測定 用總RNA提取試劑盒提取仔鼠腎臟中總RNA，再用反轉錄試劑進行逆轉錄合成cDNA，-20℃保存。采用實時熒光定量PCR法檢測目的基因GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA表達水平，引物由大連寶生物有限公司設計合成(表1)。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，39個循環。以β-actin為內參，用2-△△Ct表示目的基因的相對表達量。

表1 引物信息

1.4 數據分析應用Excle整合數據，SPSS進行單因素方差分析，Graphpad Prism 9.0繪圖，差異比較通過One-Way ANOVA評估，*表示MCZ對照組與空白對照組相比，#代表GP組與MCZ對照組相比，*/#P<0.05表示為差異顯著，**/##P<0.01表示為差異極顯著。

2 結果

2.1 對45日齡仔鼠腎臟組織形態的影響HE染色結果顯示，空白對照組，腎小球大小正常，周圍界限清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，管腔大小正常；MCZ組腎小囊囊腔變小，周圍界限不清晰，腎小管上皮細胞部分脫落，腎小管腔里充有均質紅染的不等量蛋白性物質，管腔堵塞；與MCZ組相比，GP組腎小球形狀較正常，腎小囊囊腔結構較清晰，管腔大小較正常(圖1)。

A.空白對照組；B.MCZ對照組；C.GP低劑量組；D.GP中劑量組；E.GP高劑量組。紅色箭頭.腎小囊囊腔變小，周圍界限不清晰；綠色箭頭.腎小管腔里充有均質紅染的不等量蛋白性物質；黑色箭頭.腎小管上皮細胞部分脫落

2.2 對45日齡仔鼠體質量及腎臟指數的影響如圖2所示，在體質量方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯合處理后差異不顯著；在腎臟指數方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

圖2 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠體質量和腎臟指數的影響

2.3 對45日齡仔鼠血清中Cr、BUN的影響如圖3所示，在Cr方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在BUN方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且低、中、高劑量組差異均極顯著(P<0.01)。

圖3 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠Cr和BUN的影響

2.4 對45日齡仔鼠腎臟組織中T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響如圖4所示，在T-AOC方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在MDA方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在SOD方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在GSH-Px方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且低劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖4 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

2.5 對45日齡仔鼠腎臟組織中GPX4、FSP1、TGF-β1的影響如圖5所示，在GPX4方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且中劑量組差異顯著(P<0.05)；在FSP1方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且低、中劑量組差異極顯著(P<0.01)；在TGF-β1方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且高劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.6 對45日齡仔鼠腎組織中GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達量的影響如圖6所示，在GPX4 mRNA相對表達量方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯合處理后均高于MCZ組，且低、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在NF-κB p65 mRNA相對表達量方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯合處理后，中劑量組差異顯著(P<0.05)；在NOX4 mRNA相對表達量方面，MCZ組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯合處理后均低于MCZ組，且中劑量組差異極顯著(P<0.01)，高劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖6 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達量的影響

3 討論

MCZ對雌性生殖器官的特異性作用機制尚不完全清楚，但體內試驗研究表明，該殺菌劑會損害小鼠胚胎發育和減數分裂紡錘體組裝[14]，MCZ可能在細胞水平上間接干擾或損害生殖，并應視為生殖毒物，這一點具有高度至中度的可信度[15]，除影響本代接觸者的健康外，MCZ還能通過血-胎盤和血-乳屏障[16]影響到子代的健康。MCZ帶來的生殖毒性在卵巢功能方面表現為通過抑制顆粒細胞活力，減少卵丘擴張，抑制中期板形成，誘導顆粒細胞分泌孕酮，可能抑制排卵過程中的垂體激增過程來實現[7]，在子宮方面表現為通過調節子宮內膜上皮細胞的基因表達譜和降低雌激素受體β和整合素β3的表達來減少球體附著[17]，調節蛻膜化而影響胚胎著床，并需要進一步研究確切的作用模式[18]，在中醫理論中腎臟與生殖息息相關。本試驗結果表明，GP可以抑制MCZ處理后小鼠體質量的下降和腎指數的上升。

腎臟損傷引起體內的氧化與抗氧化過程失衡造成氧化應激狀態，且腎臟對氧化應激高度敏感[19]。血清里的Cr[20]、BUN水平作為高效的腎功能生物標志物，被廣泛的用于腎病的診斷與評價。對于母胎，氧化應激過程中產生的脂質過氧化和DNA損傷等可能會造成自然流產[21]等，對體內的胚胎也會產生毒性，造成出生體質量降低、免疫低下等狀態[22]。氧化應激狀態時一方面刺激機體產生大量的ROS，引起機體的ROS積累，組織脂質過氧化程度升高，MDA水平升高[23]，損傷腎臟細胞，產生細胞凋亡、腎臟纖維化、炎癥[24]等；另一方面機體清除自由基的能力下降，表現為T-AOC、SOD、GSH-Px活性下降。T-AOC體現機體各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成總抗氧化水平；SOD可以及時修復受損細胞[25]，將超氧化物自由基轉化成過氧化氫和氧分子達到清除自由基的效果[26]，所以SOD活性可以間接體現機體清除自由基的能力；谷胱甘肽是一種主要的抗氧化劑，可以直接清除自由基，機體產生的過量的過氧化氫可以被GSH-Px代謝成水分子[27]。本試驗結果表明，GP可以抑制MCZ導致的Cr、BUN和 MDA水平的升高，抑制T-AOC、SOD、GSH-Px活性的下降，降低腎臟損傷和脂質過氧化程度。

鐵死亡有3種主要調節機制：脂質過氧化、鐵離子蓄積和氨基酸代謝紊亂。GPX4和FSP1[28]共同構成鐵死亡防御系統[29]，ROS等的存在會促進鐵死亡的發展。研究表明，GPX4能降解部分脂質過氧化物，從而抑制脂質過氧化過程，如果上調了GPX4的表達會使機體對鐵死亡更加不敏感[30]。除此之外，誘導機體鐵死亡時會導致體內ROS升高，促進脂質過氧化。本試驗結果表明，GP可以抑制MCZ帶來的GPX4、FSP1水平的降低，增加機體對鐵死亡的耐受性。

TGF-β1參與調節細胞增殖、凋亡、組織纖維化[31]、腫瘤和免疫等過程的雙向調節因子，廣泛參與體內各種病理生理過程，在腫瘤細胞中，早期抑制細胞增殖從而達到抗腫瘤作用，在晚期誘導細胞凋亡以達到抗腫瘤作用[32]，TGF-β1在炎性環境中發揮抗炎作用，而TGF-β1的過度生產則又會導致急性腎小管損傷；NOX4是NADPH氧化酶，其主要在腎臟組織表達，催化氧生成ROS，對ROS含量敏感[33]；NF-κB作為核轉錄因子參與調控多種與炎癥、抗凋亡和腫瘤等有關的基因表達。本試驗結果表明，GP在仔鼠45日齡時抑制TGF-β1水平，另外，GP還抑制MCZ導致的NOX4、NF-κB mRNA轉錄水平的升高，從而降低腎臟氧化應激程度。

綜上所述，GP通過提高45日齡仔鼠的抗氧化能力和對鐵死亡的耐受力而減輕腎臟損傷對機體帶來的影響，GP低、中、高劑量均對MCZ誘導的45日齡仔鼠的腎臟損傷有一定的抑制效果，其中以中劑量的GP(100 mg/kg)對45日齡仔鼠腎臟的保護作用最為明顯。