飼料中黃曲霉毒素B1的檢測方法研究進展

馬利霞

（ 開封市畜產品質量監測檢驗中心，河南 開封 475004 ）

飼料及飼料原料霉變是一個全球性的嚴重問題，其產生的黃曲霉毒素危害極大。黃曲霉毒素一般來自黃曲霉和寄生曲霉，目前已知的黃曲霉毒素有20余種，主要分為B1、B2、M1、M2、G1、G2等形式[1]，化學分子結構相似，其中以黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性最強。幾種主要黃曲霉毒素的化學結構見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化學結構Fig.1 Chemical structure of aflatoxin B1、B2、M1、M2、G1、G2

黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮衍生物，具有強致畸、致突變、致癌作用。一旦動物食用被黃曲霉毒素B1污染的飼料或飼料原料即可中毒[2]，并且其產生的副產物也含有黃曲霉毒素B1，可隨著食物鏈進入人體和動物體內，危害機體健康，進而造成一定經濟損失。許多國家、地區對黃曲霉毒素B1在飼料及飼料原料中的殘留限量進行了嚴格規定。國內外有學者對飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的分析檢測方法進行了大量研究，目前檢測分為前處理和檢測技術等兩部分。本文對現有的黃曲霉毒素B1檢測方法展開綜述，為進一步研究黃曲霉毒素B1新的檢測方法提供參考。

1 黃曲霉毒素B1的前處理方法

飼料及飼料原料種類多樣、基質復雜，對黃曲霉毒素B1的準確定量造成了較大干擾；而黃曲霉毒素B1痕量、高毒，往往需要一定樣品前處理技術將其從樣品中分離、富集。目前，黃曲霉毒素B1常用的前處理方法主要有溶劑萃取法、柱層析法、免疫親和柱法、固相萃取等方法[3]。

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法利用黃曲霉毒素B1易溶于極性有機溶劑中的特性，從而將其從基質中分離。飼料及飼料原料基質復雜，常使用幾種有機溶劑的混合液提取樣品中黃曲霉毒素B1。然而在提取溶劑時往往會摻入少量雜質，因此需接受相對應的凈化處理，是任何操作不可缺少的第一步[4]。

傳統的溶劑萃取法存在一定的局限性，無法準確地測定出飼料中殘留的黃曲霉毒素B1。以此方法為基礎進行創新優化生成了一些新的檢測方法，如加壓溶劑萃取法和分散溶劑微萃取法等，因溶劑萃取流程較為復雜，選擇性較低，基質對此方法的影響較大，因而同樣存在一定的局限性。

1.2 柱層析法

柱層析法是利用黃曲霉毒素B1在層析柱中利用液-液分配的原理進行提取，應用較為廣泛。隨著凈化技術發展，已開發出專用的免疫親和柱。免疫親和柱是將黃曲霉毒素B1的抗體與活性固相載體結合制成層析柱，隨著凈化深入，黃曲霉毒素B1能夠迅速地與免疫親和柱的相關抗體進行有效融合，后經洗脫液脫附，完成樣品的凈化和濃縮富集[5]。尹安胤[6]采用免疫親和色譜柱檢測分析玉米中黃曲霉毒素B1，結果顯示其加標回收率為88.5%～94.3%。現階段，在飼料及原料曲霉毒素B1測定時，免疫親和柱技術運用十分廣泛，但是該技術存在制備復雜、抗體易失活且抗體價格昂貴等缺點。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是憑借材料對組分具有獨特的影響力，在試樣溶液中能夠輕松地保留下黃曲霉毒素B1，從而實現凈化與富集的操作目的，在檢測分析飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的前處理中廣泛應用。王巖松等[7]選擇免疫親和富集黃曲霉毒素B1的固相萃取柱，對谷物中殘留的黃曲霉毒素B1進行測定分析，結果顯示，平均回收率為74.6%～89.6%，方法檢出限達到0.1 ng/g。

2 黃曲霉毒素B1的檢測方法

樣品前處理技術將黃曲霉毒素B1從樣品基體中分離且富集到合適的檢測濃度，之后通過合適的方法進行檢測。目前黃曲霉毒素B1檢測方法有：色譜法、免疫分析法、電化學分析法、生物分析法等。

2.1 色譜法

色譜法是近年來飼料及飼料原料質量分析中最富活力的領域之一，利用待測物質中各組分在兩相中吸附-溶解性的差異進行分配，最終將各組分區分開。色譜法具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少等優點，因而得到了廣泛應用。色譜法主要包括薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法等。

2.1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是早期應用最廣泛的黃曲霉毒素B1分析技術，也是我國測定黃曲霉毒素B1的標準方法之一。在國標GB 5009.22—2016中規定，薄層板上黃曲霉毒素B的最低檢出量為0.0004 μg，檢出限是5 μg/kg，回收率75%以上。薄層色譜法的作用機制則是處于365 nm狀態下時黃曲霉毒素B1可出現大規模的藍色熒光，借助這一特性，基于具體樣品選取適宜的溶劑萃取，再在薄層板上層析展開、分離，對熒光具體強度進行準確測定，并對比標準品，從而準確地計算出黃曲霉毒素B1含量。

隨著樣品純化技術和分析儀器不斷改進，使得該方法得到完善。Hoeltz 等[8]選擇使用TLC+電感耦合檢測器聯合檢測的方案檢測花生中黃曲霉毒素B1，定量限設定為1.2 μg/kg，結果非常精準。Kotinagu 等[9]選擇采用AOAC法對樣品中的黃曲霉毒素B1進行提取，并使用高效薄層色譜法對其進行測定，設定了4個熒光法波長的狀態，對其進行定量檢測，所獲取的結果同酶聯免疫分析法完全吻合。薄層色譜法具有操作簡單、檢測迅速、檢測費用低等優勢，然而其樣品前處理流程十分復雜，靈敏度較低，回收率與重復性差，不易完成自動化且樣品中其他熒光物質易對檢測結果造成干擾，在飼料及飼料原料中痕量黃曲霉毒素B1的分析應用受限，更適用于黃曲霉毒素B1的定性分析。

2.1.2 液相色譜法

液相色譜法廣泛應用于黃曲霉毒素B1的檢測工作中，包括高效液相色譜法以及液相色譜-質譜聯用法。

2.1.2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是第一個用于檢測黃曲霉毒素B1的檢測方法，也是目前應用較為廣泛的一種方法。高效液相色譜法借助檢測器分析黃曲霉毒素B1的含量，相關檢測器較多，如熒光、紫外、二極管陣列等，涉及畜牧、化工和食品等多個行業[10]。潘迎芬等[11]利用免疫親和層析凈化-高效液相色譜法檢測花生中黃曲霉毒素B1，其檢出限為0.5 μg/kg，回收率在70%～110%之間，精密度好，與國標法相比，節省了大量前處理時間，有利于提高分析效率。此外，高效液相色譜法用于檢測大米、飼料、大豆、雞肝、魚、蝦等基體中的黃曲霉毒素B1均能夠取得不錯的結果。也有研究基于HPLC柱后衍生化構建了針對花生黃曲霉毒素檢測的方法，并將其定量限制于0.11 μg/kg[12]。

高效液相色譜法的優勢主要表現為檢測快、靈敏度高、可用于大批量樣品檢測中，不超過25 min 便可獲取檢測結果，且能夠回收與再次利用樣品溶液和色譜柱。但這一檢測方法所使用的儀器較貴，對檢測人員的專業技能要求十分嚴格，推廣難度大。

2.1.2.2 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜-質譜聯用法則是借助液相色譜法的高分離效能、高選擇性、可提供分子結構信息、前處理簡單等優點，并利用質譜檢測器對黃曲霉毒素B1檢測的適用性，成為目前較先進的黃曲霉毒素B1檢測方法[13-14]。

胡莎等[15]利用超高效液相色譜-串聯質譜法測定小麥中的真菌毒素，內標進行校正，黃曲霉毒素B1的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg，加標回收率在86.6%～110.1%，該方法滿足實驗室日常檢測。任宏彬等[16]采用液相色譜-串聯質譜法對黃曲霉毒素B1進行測定，其檢測值控制在70 ng/kg，回收率為85.0%～94.1%，相對偏差小于等于5.5%。

目前，液相色譜-質譜技術日益成熟，靈敏度得到有效提升，樣品無須進行稀釋，可有效預防凈化環節中損失目標物的情況，不再依賴凈化材料，檢測投入費用相對有所降低。但這一檢測方法在離化環節中基質的影響較明顯，對黃曲霉毒素B1的定量準確度造成了影響，且儀器設備昂貴，檢測成本高，操作步驟復雜，導致普及率不高。

2.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法則是借助載氣將氣化樣品輸入色譜柱中，經過組分與固定的互相作用力之間的差異而實現分離。20世紀70年代，氣相色譜法開始應用于霉菌毒素的檢測。氣相色譜法能夠對霉菌毒素進行準確的定性分析[17]，且靈敏度高、檢測限更低，但該法只適用于分離檢測揮發性較大并且熱穩定性較強的物質。但黃曲霉毒素B1揮發性差，在一定程度上限制了氣相色譜法的應用。

2.2 電化學分析法

電化學分析法則是根據物質所具有的電化學特性與相關變化，定量、定性分析組分，目前有越來越多的新型電化學分析技術出現，并廣泛應用于檢測黃曲霉毒素B1的工作中[18]。

Mo 等[19]采用共價鍵結合的方法，將核酸適配體有效地固定于多孔陽極氧化鋁納米通道的表層中，對氧化石墨烯制備核酸適配體功能化的電化學傳感器進行針對性修飾，并將檢測黃曲霉毒素B1的測定范圍控制在0.13 μg/L。Xiao 等[20]嘗試采用核酸適配體修飾的毛細管電泳技術檢測食品中的黃曲霉毒素B1，在1×10-8～1×10-4g/mL 線性范圍內，能滿足食品中痕量黃曲霉毒素B1 的測定。Xia等[21]則嘗試把多孔納米片作為熒光探針，以此為基礎研發了基于磁性納米顆粒的黃曲霉毒素B1免疫傳感器，檢測靈敏度、特異性高，檢測限確定在0.002 μg/L；還嘗試使用免疫分析技術對電化學傳感器進行科學制備，準確地測定霉菌毒素。Nabok 等[22]使用偏振衍射儀，以此為基礎研發了一種免疫傳感器，并結合了平面波傳導檢測原理，檢測限確定在0.01 μg/L。電化學分析法可高效率、精準地檢測，且檢測靈敏度高，但重復性差、檢測器昂貴，廣泛應用推廣難度較大。

2.3 熒光光度法

黃曲霉毒素B1熒光光度檢測技術根據黃曲霉毒素B1的熒光特性而研發，能夠對黃曲霉毒素B1進行直接、高效率檢測。其方法是提取甲醇，并對樣品進行稀釋與過濾處理，針對特異抗體對其予以免疫親和柱層析凈化，之后清除純凈水中的各種雜質，并借助甲醇對其進行洗脫處理，加入適量的溴，之后衍生并借助熒光光度計進行準確測定。熒光檢測法檢測費較低，操作便捷，無須同黃曲霉毒素B1的標準品進行對比，對檢測人員的傷害較小，值得廣泛推廣。

2.4 免疫分析技術

免疫分析技術是基于抗原、抗體分子結合，形成抗原抗體復合物的分析方法，具有選擇性、特異性、靈敏度高以及簡便快速等優點[23]，包括酶聯免疫吸附法、免疫層析法、免疫親和色譜儀器結合測定法及熒光偏振免疫檢測法等。

2.4.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫法選擇在酶標板附上相關已知抗原，將酶標記抗體與樣品進行有效混合，兩者有效反應后再將多余的抗體洗凈，添加適量酶底物，滋生出大量有色物質，再滴入終止液，反應停止，對抗原或抗體進行光度檢測[24]。酶聯免疫法可精準測量出黃曲霉毒素B1的具體含量，特異性相對較高，檢測流程簡單，結果分析比較簡單。

王潔蓮等[12]檢測小米中的黃曲霉毒素B1時使用酶聯免疫吸附法，檢出限可達0.1 μg/L，回收率達75%以上。陳旭明等[25]利用酶聯免疫吸附結合免疫親和柱-高效液相色譜法檢測大米中黃曲霉毒素B1，檢出限為0.50 μg/kg，回收率為89.4%～95.2%，結合應用兩種方法適用于大批量樣品檢測。近年來，酶聯免疫法獲得很大改進，建立了許多快速檢測方法，如黃曲霉毒素B1試劑盒、黃曲霉毒素B1試紙等。馬俊等[26]利用黃曲霉毒素B1-ELISA測試盒檢測飼料中黃曲霉毒素B1的含量，結果顯示，最低檢出限為0.1 μg/L，黃曲霉毒素B1的含量在5.0～30.0 μg/kg 時，標準曲線的相關系數r=0.999 4，變異系數小于1%，回收率在94%～105.0%。酶聯免疫法靈敏度高、特異性強，干擾物少，提取環節較為便捷，能夠對大批量樣品同時進行測定，且具有較高的回收率，值得廣泛推廣。但因為酶的活性受條件影響較大，測定結果穩定性差，易出現假陽性，分析結果準確性不高。

2.4.2 免疫層析法

免疫層析法是一種快速免疫分析技術，樣品借助毛細作用在條狀纖維膜上泳動，黃曲霉毒素B1與膜上特定區域的配體結合，通過酶促顯色或直接著色標記。膠體金免疫層析以膠體金作為示蹤標志物，對單克隆抗體進行精準標記，從而實現定性或定量檢測。劉曉玥等[27]利用膠體金免疫層析法進行黃曲霉毒素B1的檢測，結果顯示，檢出限為2.5 μg/L，該檢測方法靈敏度高、效率高，精準度高達85%，能夠在10 min內檢測出樣品中的黃曲霉毒素。

綜上，免疫層析法較為便捷，特異性、靈敏度相對較高，環保效能感強，檢測對象多，且比較實惠，可廣泛應用于快速檢測大批量樣本工作中，使用前景十分可觀，但實際操作中假陰性、假陽性的情況較為常見。

2.4.3 其他免疫法

放射免疫法則是通過準確地標記具有放射性同位素的標記物進行檢測。標準品準確標記同素位，并完全同樣品混合，添加特異性抗體對其放射情況進行精準呈現，準確計算抗原濃度。閆磊等[28]利用放射免疫法檢測牛奶中的黃曲霉毒素B1，結果顯示，檢測限達到0.5 μg/kg。

熒光偏振免疫測定法通過標記熒光素測定黃曲霉毒素B1，相關研究相對較少[29]。熒光標記的黃曲霉毒素B1與樣品中的黃曲霉毒素B1能夠與適量的抗體進行競爭融合平衡相關反應，表明熒光標記的黃曲霉毒素B1與樣品的濃度呈反比[30]。

時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）是一種最新的檢測方法，主要應用于超微量檢測，靈敏度高達10～19，可借助免疫反應的高度特異性以及標記示蹤物的靈敏性進行融合。TR-FIA 的標記物離子能夠出現大量熒光，其熒光不僅具有較高的強度，且衰變時長相對較高，待測樣品中壽命相對較短的自然熒光出現衰變趨勢后，對其離子熒光進行測定。TR-FIA 在黃曲霉毒素B1的檢測前景較廣，但難以實現自動化，且整個合成抗體的過程較為繁雜，費用相對較高，往往需要使用高科技儀器，不利于該技術在黃曲霉毒素B1檢測領域的發展和應用。

3 展望

目前飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的檢測方法種類較多，但各具優缺點。飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1檢測技術備受關注，日益成熟，且不斷地調整與優化相關法律法規及標準，有效地保障食品的安全性，需聯合使用各種檢測方法，以此獲得精準的數據。今后黃曲霉毒素B1的檢測方法主要的發展趨勢有：研發新型高選擇性材料，改進黃曲霉毒素B1的前處理過程。液相色譜-質譜聯用技術的應用越來越廣，可有效地控制檢測費用，加快檢測效率，符合相關監管機構的檢測要求。