新疆某地區(qū)牛場乳房炎流行調查及病原分離、藥敏試驗

喬彥杰，魏 勇，解津剛，蔣 松*

（ 1. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000 ； 2. 新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000 ）

“二十大”以來，我國畜牧業(yè)發(fā)展迅速，新疆的奶牛業(yè)也成為農業(yè)發(fā)展的重點內容。隨著奶牛業(yè)不斷發(fā)展，越來越多的養(yǎng)殖場開始重視奶牛乳房疾病的防治[1]。其中，奶牛乳房炎會導致乳品質、產量下降，治療和管理成本增加，同時還會造成抗生素藥物殘留，嚴重影響人類的生活品質和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。有報道稱，我國每年因隱性乳房炎損失近1.35 億元，每頭患病奶牛平均日產奶量減少3.7 kg，約損失1 200～3 600元，可見乳房炎對牛場產奶量影響頗深[3]。此外，乳房炎還會引起奶牛產后下次發(fā)情和妊娠時間延長，甚至影響奶牛生產性能，造成嚴重的經濟損失[4]。因此，防治乳房炎已成為眾多畜牧行業(yè)科研工作者研究的熱點。本研究以新疆某地區(qū)牛場乳房炎流行調查及病原分離、藥敏試驗為切入點，開展奶牛乳房炎調查研究，為新疆地區(qū)奶牛乳房炎的有效防治及奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機選取新疆地區(qū)部分規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場108頭無乳房癥狀的泌乳奶牛為調查對象，無菌采集432份乳汁，置于冰盒送回實驗室，做隱性乳房炎檢測。試驗期間檢測其中兩批（4 月份305 頭，6 月份323 頭）泌乳奶樣的體細胞數。奶牛年齡為2～10歲。

1.2 主要儀器與試劑

試驗儀器：普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司，綿羊血瓊脂培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，LB 肉湯培養(yǎng)基購自上海生工生物工程股份有限公司，藥敏試紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司，KENOTEST 隱性乳房炎檢測試劑購自CID LINES公司，革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

試驗儀器：光學顯微鏡（Olympus 公司），純水機（Therom Fisher 公司），高壓滅菌器（Hirayama 公司），冰箱（海信集團有限公司），旋渦混合器（Scientific Industries 公司），電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），超凈工作臺（上海鴻都電子科技有限公司），離心機（Sigma公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），全自動振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），微量移液器及大容量移液槍（英國Bibby 科技有限公司），牛博士Ⅲ型體細胞檢測儀器（華誠睿光（中國）生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 臨床乳房炎檢查

主要通過乳房視診和觸診、乳汁的肉眼觀察及必要的全身檢查。乳房腫脹發(fā)紅，觸診發(fā)熱，乳汁有絮狀物或凝塊、黃白色或血清樣，擠不出乳汁或僅能擠出少量水樣乳汁，即可診斷為臨床乳房炎。患牛伴有全身癥狀，精神萎靡、食欲減少、體溫升高、心率加快、呼吸頻率增加等癥狀。

1.3.2 隱性乳房炎檢查

采樣凝集盤檢測法，采樣前棄掉前3把奶，在每個乳杯中收集樣奶2 mL，加入KENOTEST隱性乳房炎檢測試劑，充分混勻后根據混合物的凝集情況及顏色變化進行綜合判斷。其中，以“++”以上判定為隱性乳房炎[5]。隱性乳房炎判定標準見表1。

表1 隱形乳房炎判定標準Tab.1 Criteria for diagnosis of invisible mastitis

1.3.3 體細胞測定及分析

分別于4 月和6 月采集泌乳奶牛奶樣，采用牛博士Ⅲ型體細胞檢測儀器檢測體細胞數，并使用Excel 軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

1.3.4 病原菌分離鑒定、分離菌形態(tài)學觀察

隨機采取乳房炎陽性乳區(qū)奶樣43份，奶樣經過前增菌后，分別吸取100 μL涂布于普通瓊脂、麥康凱瓊脂、綿羊血平板等固體培養(yǎng)基，同時接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察菌落生長情況及形態(tài)特征。

挑取單個菌落涂片，經革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。根據菌落形態(tài)特征、溶血與否、染色特性、菌體形態(tài)及生化試驗進行鑒定。

1.3.5 主要病原菌耐藥試驗

將多次分離純化后得到的金黃色葡萄球菌、鏈球菌，分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基，恒溫搖床內增菌培養(yǎng)24 h，生理鹽水將菌液濃度調節(jié)至10～20 CFU/mL。按照紙片法的操作，吸取適量菌液涂布在瓊脂平板上，取出不同藥敏紙片，并用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，置37 ℃培養(yǎng)箱生長12 h后觀察并測定抑菌情況。

2 結果與分析

2.1 臨床乳房炎檢測結果（見表2）

由表2 可知，按乳區(qū)統(tǒng)計，平均臨床乳房炎陽性率為10.19%，其中以右后乳區(qū)陽性率為最高，為11.11%。

表2 臨床乳房炎檢測結果Tab.2 Clinical mastitis test results

2.2 隱性乳房炎檢測結果（見表3）

由表3 可知，平均隱性發(fā)病率為34.26%（279/2 908）。其中，以左前乳區(qū)陽性率為最高，為44.44%（84/727）；左后最低，為25.00%（59/727）。

表3 隱性乳房炎檢測結果Tab.3 Results of occult mastitis test

2.3 體細胞檢測結果（見表4）

由表4 可知，試驗期間檢測其中兩批泌乳奶樣的體細胞數，第一次測定結果顯示，平均體細胞數為73.28 萬，體細胞數大于等于40萬占比為81.31%（248/305）。經過2個月治療之后進行第2次測定，其平均體細胞數為56.25萬，體細胞數大于等于40萬占比為78.33%（253/323）。

表4 體細胞檢測結果Tab.4 Somatic cell test result

2.4 主要病原菌分離與鑒定及形態(tài)學特征（見圖1、表5）

由圖1、表5 可知，經過分離培養(yǎng)和生化鑒定，共從43份可疑奶樣中分離到36株菌株，其中，以葡萄球菌分離率最高，為66.67%；其次為鏈球菌，分離率為14.29%；此外，分離到2株革蘭氏陰性菌。

表5 乳房炎病原菌分離鑒定情況Tab.5 Isolation and identification of pathogenic bacteria from mastitis

圖1 病原菌分離與鑒定及形態(tài)學特征Fig.1 Isolation and identification of pathogenic bacteria and morphological characteristics

結果表明，該牛場奶樣帶菌情況較為嚴重，應引起高度重視。

2.5 分離菌株藥敏試驗結果（見表6）

由表6可知，28株葡萄球菌均對多西環(huán)素敏感，83.3%的鏈球菌對多西環(huán)素敏感，50%的革蘭氏陰性菌對多西環(huán)素敏感。鏈球菌和革蘭氏陰性菌對青霉素G、氨芐西林、林可霉素均不敏感。

表6 分離菌株藥敏試驗結果Tab.6 Results of drug sensitivity test for isolates

3 討論

本次調查研究發(fā)現，新疆部分地區(qū)仍存在較高的奶牛乳房炎發(fā)病率，其乳區(qū)平均臨床乳房炎陽性率為10.19%，平均隱性發(fā)病率為34.26%。低于劉建貴等[6]報道的奶牛隱性型乳房炎發(fā)病率平均為74.50%，臨床型乳房炎的發(fā)病率平均為33.41%。羅金印等[7]調查發(fā)現，成都、蘭州、鄭州、濟南、哈爾濱、南昌等6個城市的奶牛場隱性乳房炎發(fā)病率在50%～80%之間。而本調查中新疆地區(qū)隱性乳房炎的發(fā)病率略低于羅金印等[7]的報道，也可能是因地域、氣候不同的原因造成，新疆氣候比較干燥，不利于病原菌生長。雙金等[8]報道內蒙古地區(qū)隱性乳房炎乳區(qū)陽性率為32.28%，與本調查接近。

在生產實踐中，檢測體細胞數是鑒別乳區(qū)、牛、牛群乳房健康狀態(tài)最有效的方法，受年齡、胎次、機體應激、個體特征以及擠奶操作等因素影響，當乳腺受到感染時，乳中體細胞數增加，產奶量降低[9]。本試驗對兩批奶樣進行了跟蹤監(jiān)測體細胞，第一次測定結果顯示,平均體細胞數為73.28萬，體細胞數大于等于40萬占比為81.31%；經過2個月治療之后進行了第2 次測定，其平均體細胞數下降為56.25萬，體細胞數大于等于40萬占比為78.33%。體細胞下降的原因與牛場使用抗生素治療有關，也與泌乳牛的胎次、季節(jié)溫度升高有關[10]。但經過治療后仍然有8.05%的奶樣體細胞數大于等于100萬，這可能是隨著奶牛產后時間延長，體細胞數也會隨之增多[10]。因此，在奶牛飼養(yǎng)管理方面，還需要提高外部飼養(yǎng)條件、改善飼養(yǎng)環(huán)境，并提前對隱性乳房炎進行藥物干預治療。

細菌感染在動物飼養(yǎng)中也較為常見。金黃色葡萄球菌常存在于牛的皮膚，可定植于奶牛的乳腺上皮組織細胞，從而形成膿腫。大多數抗生素可完全抑制已經進入乳腺上皮細胞間的細菌[11]，因此一些無力淘汰奶牛的牧場寄希望于在干奶期治療金黃色葡萄球菌感染。鏈球菌主要在被感染的乳腺內存在，在奶牛乳房外緣和擠奶工的皮膚上存活時間很短[12]。感染鏈球菌后，奶樣中的體細胞數通常很高，個別甚至達到2 000～5 000個/mL。有效對抗鏈球菌的核心控制關鍵點是做好擠奶前藥浴，關注藥浴液的有效濃度、藥浴作用時間、擦干效果以及擠奶設備保持正常。本研究結果顯示，葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌是引起新疆地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌，并且以葡萄球菌分離率最高，其次為鏈球菌，與陳杰[5]、劉長彬等[13]報道的有關新疆地區(qū)奶牛乳房炎結果基本一致。

針對上述兩種病原菌，在臨床中應該重點加強擠奶器消毒，嚴格規(guī)范擠奶規(guī)程，定期做好泌乳期、干乳期乳房保健等，以有效切斷傳播途徑；同時建立科學的飼養(yǎng)管理制度、加強環(huán)境和牛體衛(wèi)生，以清除環(huán)境中的致病菌[14]；其次對隱性乳房炎患病牛群應盡快分群，減少致病菌的交叉?zhèn)鞑ィ乐够旌细腥局虏【某唧w細胞牛數增多；對妊娠后期的乳房炎奶牛進行干奶治療，利用針對性的抗生素和乳頭封閉劑進行治療加干奶[15]，加強細菌檢測，以確保治療效果；對隱性乳房炎的牛群適當增加免疫力提升的輔助添加劑，提升奶牛的免疫健康；若存在細菌感染風險的牛建議進行分批、逐步淘汰。

由藥敏試驗結果可知，引起新疆地區(qū)奶牛乳房炎的幾種主要病原菌對大多數抗菌藥物具有較好的敏感性，但長期反復使用一種或兩種抗生素容易形成耐藥菌株，造成再度感染，并且抗生素在乳制品中殘留會影響人類健康[16]。因此，除了考慮到藥物治療針對的病原菌產生耐藥性外，還要結合抗生素敏感試驗以及對乳房的刺激性試驗等選擇有效的抗生素。本試驗分離的菌株主要對頭孢類、四環(huán)素類藥物（如多西環(huán)素、頭孢曲松）具有較強的敏感性，由此可為新疆部分地區(qū)奶牛場防治乳房炎的臨床用藥提供一定參考。

4 結論

本研究調查發(fā)現，新疆該地區(qū)隱性奶牛乳房炎發(fā)病率較高，可采用頭孢類、四環(huán)素類藥物針對性進行治療，降低乳房炎的發(fā)病率。