1 起黃藍金剛鸚鵡蠟狀芽孢桿菌感染的診療

楊 志，楊名龍，王 宇，孫玉林，李冠宗，王 康，楊福梅，代飛燕*

（ 1. 云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201 ； 2. 大理市動物疫病預防控制中心，云南 大理 671003 ； 3. 昆明市官渡區動物疫病預防控制中心，云南 昆明 650214 ； 4. 昆明市技術合同認定登記站，云南 昆明 650021 ； 5. 華中農業大學動物科學技術學院，湖北 武漢 430070 ）

蠟狀芽孢桿菌是一種分布廣泛、好氧、喜中溫、產芽孢的革蘭氏陽性桿菌，常見于土壤、空氣、水中，耐受性強，能夠在惡劣環境中生存[1]，易污染谷類、粉狀食品、馬鈴薯泥、乳及乳制品[2-3]。蠟狀芽孢桿菌可產生多種不同的腸毒素，包括溶血素、非溶血性的腸毒素、細胞毒素等，可導致腹痛、嚴重腹瀉[4]。在許多國家，由蠟狀芽孢桿菌引起的、較為嚴重的食物中毒事件早已有報道，中毒者表現嘔吐、腹瀉等癥狀[5]。國內也有研究報道了蠟狀芽孢桿菌引起傷口感染、食物中毒，甚至是肺炎及敗血病的情況。蠟狀芽孢桿菌感染家畜還會引起牛乳房炎和子宮內膜炎、馬表皮潰爛、豬腹瀉等疾病[6-8]。也有研究表明，蠟狀芽孢桿菌感染可能會導致牛猝死[9]，還可引起人類的眼疾、敗血癥和心腦膜炎等疾病[10]。本文報道了一例蠟狀芽孢桿菌引起藍黃金剛鸚鵡反復腹瀉且難以治愈病例的診療經過，為相關疾病的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

昆明市某鸚鵡觀賞園中的一個鸚鵡群出現不同程度的腹瀉情況，發病鸚鵡排白色、綠色稀糞或水樣糞便，采取治療后病情依舊反復，無法痊愈。

其中一只黃藍金剛鸚鵡腹瀉程度尤為嚴重，采食量嚴重下降、被毛臟亂、精神沉郁、排綠色水樣糞便、機體逐漸消瘦。按照無菌采樣要求，采集該患病黃藍金剛鸚鵡泄殖腔棉拭子，進行細菌培養分離鑒定。

1.2 試驗材料

試驗儀器：生化恒溫培養箱（上海恒科科技有限公司）、水浴恒溫振蕩器（金壇杰瑞爾電器有限公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）。

培養基與試劑：胰酪大豆培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、哥倫比亞血瓊脂平板、DL2000 DNA Marker，購自生工生物工程（上海）股份有限公司，藥敏片和微量生化反應管購自杭州濱和微生物試劑有限公司，Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，FinePure 通用型基因組柱式提取試劑盒購自濟凡生物科技（北京）有限公司。

1.3 細菌分離培養

在生物安全柜內用接種環將病料接種至TSB 培養基中，37 ℃、120 r/min增菌培養18～24 h。采用三區畫線法接種TSB 增菌液到TSA 培養基上培養，37 ℃恒溫培養24～36 h，觀察生長情況。挑取優勢單菌落接種到TSB培養基中，37 ℃、120 r/min 純化培養24 h，血瓊脂培養基上37 ℃恒溫培養24 h，觀察生長形態和菌落形態。

1.4 生化鑒定試驗

將分離菌株接種于微生物微量生化鑒定管，按照說明書要求進行操作，對各項生化指標進行鑒定，并參照《常見細菌系統鑒定手冊》[11]進行判定。

1.5 16S rRNA鑒定

將分離菌株采用濟凡細菌基因組DNA 提取試劑盒，并根據試劑盒說明書步驟提取該細菌菌株的核酸。采用細菌通用引物進行PCR擴增，所得PCR產物送至上海生工生物工程有限公司昆明分公司進行基因測序。

1.6 藥敏試驗

采用標準紙片法（K-B 法）進行藥敏試驗。菌液吸取200 μL注入MH瓊脂培養基，用無菌的三角棒將菌液均勻涂布在MH瓊脂培養基上，復方新諾明、阿米卡星、卡那霉素等抗生素貼片完成后，將平板倒置在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈直徑，統計結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養及染色鏡檢結果（見圖1、圖2）

由圖1可知，TSA 培養基上可見中間厚邊緣薄、白色、圓形的中等大小菌落。菌落在哥倫比亞血瓊脂平板上生長良好，菌落形態呈白色圓形、表面光滑、中間隆起、邊緣整齊，出現明顯的β溶血現象。

圖1 血平板菌落形態Fig.1 Morphology of colony on blood plate

由圖2可知，菌液純化涂片進行革蘭氏染色鏡檢，鏡檢結果為革蘭氏陽性桿菌。

圖2 菌株染色鏡檢結果Fig.2 Results of microscopic examination of isolated strains

2.2 生化鑒定結果（見表1）

由表1 可知，分離株與標準菌株蠟狀芽孢桿菌基本一致，初步鑒定所分離目標菌株為蠟狀芽孢桿菌。

表1 生化鑒定結果Tab.1 Biochemical identification results

2.3 16S rRNA鑒定結果（見圖3）

由圖3 可知，分離菌株采用通用引物進行PCR 擴增，擴增結果顯示目的條帶為1 500 bp，與預期結果相同。

圖3 分離菌株PCR電泳結果Fig.3 PCR electrophoresis of isolated strains

分離菌株基因序列經NCBI 數據庫比對，結果顯示與蠟狀芽孢桿菌B4同源性為99.86%。

2.4 藥敏試驗結果

按標準紙片對分離株進行藥敏試驗，結果顯示，分離菌株對復方新諾明、阿米卡星、卡那霉素、磺胺異亞唑、多西環素、諾氟沙星、頭孢哌酮、頭孢拉定、阿莫西林等9種抗生素均表現耐藥。

2.5 治療

首先清理鸚鵡舍內的糞便污物，鸚鵡舍、食槽、水槽、活動院落清理干凈后用過氧乙酸噴灑消毒，地面用3%火堿進行徹底消毒。防鼠防鳥，避免與野鳥接觸；加強飼養管理，禁止飼喂霉變污染飼料，科學搭配飼料，補充維生素及各種礦物質添加劑。

根據臨床癥狀及藥敏試驗結果，采用中藥組方F1 進行治療。F1 組成：夏枯草5 g，菊花5 g，白芍10 g，黨參15 g，茯苓15 g，山藥15 g，白術15 g，黃芪10 g，補骨脂20 g，打粉120 目過篩?；疾←W鵡5 g/（只·d），同群輕微或無癥狀鸚鵡2 g/（只·d），拌料混勻，每天兩次隨料飼喂，連用7 d，之后藥量減半再喂7 d。

采用上述處方投喂3 d 后，患病黃藍金剛鸚鵡腹瀉情況好轉，糞便開始成形，為稀粥樣糞便，排便次數及綠色糞便減少；同群其他重癥鸚鵡情況也出現好轉，輕微癥狀的鸚鵡停止腹瀉，糞便逐漸趨于正常，未出現新增病例；全群鸚鵡精神狀態及采食情況好轉。投喂7 d 后，全群鸚鵡采食量、精神狀態以及糞便形態、次數均恢復正常。14 d后，鸚鵡群內未出現再次腹瀉的情況。

3 討論

本研究從黃藍金剛鸚鵡腹瀉糞便中分離到1株具有溶血性的革蘭陽性短桿菌，經生化鑒定及16S rRNA 基于測序比對，最終確定該菌株為蠟狀芽孢桿菌。有文獻報道，蠟狀芽孢桿菌對頭孢拉定、頭孢哌酮、阿米卡星等抗生素敏感[12-13]。但本研究所分離的該鸚鵡源性蠟狀芽孢桿菌菌株B4 對所使用的復方新諾明、阿米卡星、卡那霉素、磺胺異亞唑、多西環素、諾氟沙星、頭孢哌酮、頭孢拉定、阿莫西林等9 種抗生素均不敏感，對治療用藥造成極大難度。究其原因可能是該患病鸚鵡尿酸鹽變綠，反復腹瀉，時間長達兩個多月，在此期間因疑是綠膿桿菌感染采用了大劑量的多種抗生素輪換治療，也使用了益生菌進行胃腸調理，癥狀并未得到改善。長期大量抗生素使用，不僅會導致腸道菌群紊亂、胃腸功能下降，也使菌株對抗生素敏感性降低，導致本研究分離到的菌株對多種抗生素產生了耐藥性。由此可見，隨著抗生素廣泛應用，細菌耐藥性問題日益突出，而現在的化學藥抗生素相對匱乏，眾多學者將目光投向了來源廣、安全性高、毒副作用小或無毒副作用的中草藥。中草藥含有多種混合成分，如氨基酸、多糖、多種維生素等，不僅能夠調節體內微生物菌群、抗菌消炎等作用，而且不會導致細菌產生耐藥性[14-15]。

腸毒素是引起食源性疾病的主要毒素，蠟狀芽孢桿菌所產生的腹瀉型腸毒素主要分為3 類：溶血性腸毒素（Hbl）、非溶血性腸毒素（Nhe）與細胞毒素（K）[16]，其中Hbl與Nhe毒素為引起腹瀉的主要毒素。Hbl對細胞的破壞主要針對細胞膜，通過L1、L2及B亞基依次與細胞膜進行結合，溶解結合部位的細胞膜，形成孔洞，從而破壞細胞膜。Nhe 蛋白由NheA、NheB、NheC 等3 種蛋白亞基組成，Nhe亞蛋白釋放到菌體外后，NheB與NheC進行組裝形成寡聚體，在NheC單體誘導下，宿主細胞膜表面受體與寡聚體中的NheB結合，之后NheA與寡聚體結合形成復合體使細胞膜產生孔洞，導致胞內離子外流，最終致使細胞在膠體滲透作用下溶解死亡。蠟狀芽孢桿菌感染鸚鵡機體，菌體增殖產生腸毒素，在腸毒素Hbl和Nhe的作用下，導致嚴重腹瀉。使用抗生素可在一定程度上殺滅細菌，但毒素對機體的損傷卻很難修復，從而出現反復腹瀉，機體功能下降。

由該患病鸚鵡感染的蠟狀芽孢桿菌菌株藥敏試驗結果可知，常用抗生素均耐藥或無效，根據其病史和久泄不止的癥狀特征分析，病位在脾胃和大腸，屬脾胃虛弱之象。病因多由肝木乘脾土、脾腎陽虛而起，因此，治療以健脾益氣、柔肝清肝散結、助陽為原則，選用黨參、茯苓、白術、山藥、黃芪健脾益氣，白芍柔肝，夏枯草、菊花清熱散結消腫，補骨脂補腎助陽，進行全面調理。

綜上所述，在久泄鸚鵡的臨床治療過程中，以中醫辨證論治，準確辨證為基礎，選擇相應的藥物組方進行治療，取得了良好效果，為該類疾病的臨床治療提供了新的思路和參考。

4 結論

根據鸚鵡臨床癥狀及細菌分離鑒定診斷，該鸚鵡群腹瀉是由蠟狀芽孢桿菌感染引起。采用自擬復方中藥拌料投喂治療7 d后患病鸚鵡臨床癥狀消失，飲食、精神狀況逐漸恢復正常。試驗結果可為鸚鵡同類疾病的臨床治療提供新思路和參考。