遼寧地區5 株H1N1亞型豬流感病毒分子特征與遺傳進化分析

魏 澍，蘭德松，張皓淳，孫世宇，劉 立，費東亮

（ 1. 遼寧省農業發展服務中心，遼寧 沈陽 110034 ； 2. 內蒙古赤峰市克什克騰旗農牧局，內蒙古 赤峰 024000 ； 3. 錦州醫科大學實驗動物中心，遼寧 錦州 121001 ）

豬流感是由豬流感病毒（SIV）引發的在豬中流行的呼吸道傳染性疾病，主要臨床癥狀包括咳嗽、發熱、嗜睡、厭食、呼吸困難、流鼻涕等[1]。豬流感一年四季均可發生，其中春秋兩季更易發，發病率接近100%，盡管死亡率不高，但仍給養豬業帶來了嚴重經濟損失[2]。SIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，由8條單股、負鏈RNA組成，分別編碼結構蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NEP）和非結構蛋白（NS1、PB1-F2、PB1-N40）[3]。因豬呼吸道上皮細胞內存在α-2,3 唾液酸受體和α-2,6 唾液酸受體，既能夠感染人流感病毒，也能夠感染禽流感病毒，使豬在流感病毒的變異、重組和跨宿主傳播的過程中起到“混合器”的作用。因此SIV也具有重要的公共衛生學意義[4-6]。目前，我國SIV 流行亞型主要以H1和H3亞型為主，其中歐亞類禽H1N1（EA H1N1）在我國豬群中廣泛流行并形成了穩定的遺傳譜系[7]，但遼寧地區豬群中SIV 分子特征和遺傳演化規律尚不清楚。本研究對遼寧地區規模化豬場疑似豬流感的病料中分離鑒定的5 株SIV 全基因序列進行系統分析，揭示遼寧地區SIV分離株的分子特征與遺傳演化關系，為我國豬流感的分子流行病學調查及科學防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5株H1N1SIV：A/swine/Liaoning/972/2017（LN972）、A/swine/Liaoning/977/2017（LN977）、A/swine/Liaoning/995/2017（LN955）和A/swine/Liaoning/1011/2017（LN1011）、A/swine/Liaoning/752/2019（LN752）采自遼寧地區規模化豬場具有豬流感癥狀的豬肺臟組織，保存于遼寧省動物疫病預防控制中心實驗室。9～10 日齡SPF 雞胚購自遼寧益康生物制品有限公司。

1.2 病毒分離與鑒定

將保存樣品按照國家標準GB/T 27536—2011 方法進行處理后，取250 μL上清液接種于10日齡的SPF雞胚中，置于37 ℃恒溫培養箱培養72 h 后收取雞胚尿囊液，進行血凝試驗。提取血凝陽性樣品的總RNA，進行RT-PCR反應，對分離毒株進行初步亞型鑒定。其中，SIV反轉錄通用引物為Uni-12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'），SIV 亞型鑒定引物序列均參考農業農村部動物流感重點開放實驗室所用序列，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病毒的基因序列測定

使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（北京天根生物科技有限公司）提取病毒RNA。參考全國流感監測方案（2017 版）推薦的二代測序通用引物，利用SuperSript Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platimum Taq試劑盒（賽默飛公司）對提取的RNA 進行RT-PCR 擴增，獲得的特異性擴增產物使用Beads-PCR-250G AxyMag PCR Clean-up Kit（Axygen公司）進行純化。純化后產物送至諾禾致源公司，委托其利用Illumina HisSeqTM2500測序平臺進行測序。

1.4 病毒分子特征與遺傳演化分析

應用NCBI 網站Blast 檢索同源性，生信軟件Lasergene7.1 進行核苷酸序列分析和同源性比較，通過軟件MEGA 7.0 鄰接法Neighbor-joining method 和Kimura 2-parameter 模型（參數設置為1 000 replications）與參考序列構建遺傳進化樹，選擇經典型H1N1SIV 參考毒株（A/swine/Guangdong/06/2009）、類人H1N1SIV 株（A/swine/Henan/01/2006）、人H1N1流感病毒參考毒株（A/Michigan/45/2015）、類禽H1N1SIV 株（A/swine/Shanghai/1205/2017）等作為參考序列。通過Net NGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）預測HA基因上潛在的糖基化位點。

2 結果與分析

2.1 分離株HA 基因序列關鍵氨基酸位點比較分析與遺傳進化分析（見表1～表3、圖1）

圖1 5株H1N1 SIV分離株HA氨基酸序列系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA amino acid sequence in five H1N1 SIV isolates

表1 分離株與參考株HA蛋白裂解位點與受體結合位點分析結果（受體結合位點130位環）Tab.1 Analysis results of HA protein cleavage sites and receptor binding sites of isolates and reference strains (130 ring of receptor binding site)

表3 分離株與參考株HA蛋白裂解位點與受體結合位點分析結果（受體結合位點220位環）Tab.3 Analysis results of HA protein cleavage sites and receptor binding sites of isolates and reference strains (220 ring of receptor binding site)

表2 分離株與參考株HA蛋白裂解位點與受體結合位點分析結果（受體結合位點190位螺旋）Tab.2 Analysis results of HA protein cleavage sites and receptor binding sites of isolates and reference strains (190 helix of receptor binding site)

檢測結果顯示，5 株H1N1亞型分離毒株HA基因ORF長度均為1 701 bp，編碼566個氨基酸。5株遼寧地區分離株HA基因核苷酸序列同源性在95.4%～99.7%之間，氨基酸同源性在96.1%～99.3%之間。

由表1～表3 可知，5 株H1N1分離株的HA 裂解位點均為PSIQSR↓G，符合低致病性SIV 特征；參考Graaf 等[8]確定的HA 蛋白受體結合位（RBSs）區域由3 個部分組成：130 位環（131～140）、190 位螺旋（191～199）和220 位環（220～229）。在130 位環區域，分離株與類禽H1N1SIV 參考株最為接近，其中LN752 分離株完全一致，其他4 株在133位由R突變為K。在190位螺旋區域和220位環區域，分離株與類禽H1N1SIV株氨基酸序列高度一致，僅LN977株在194 位由L 突變為I。各分離株之間位點差異很小，252位處LN752株與LN995株由E突變為G。

對分離株HA 基因進行糖基化預測，結果顯示，存在27NNS29、40NVT42、212NHT214、291NCT293、498NGT500和557NGS559等6個潛在糖基化位點。

由圖1 可知，5 株SIV 分離株與A/swine/Liaoning/96/2012（H1N1）株、A/swine/Henan/727/2013（H1N1）株遺傳關系更近，屬于類禽SIV分支。

2.2 分離株NA 基因序列關鍵氨基酸位點比較分析與遺傳進化分析（見表4、圖2）

5 株H1N1SIV 遼寧分離株NA基因的ORF 全長均為1 410 bp，編碼469 個氨基酸。5 株H1N1分離株的NA基因核苷酸序列同源性97.3%～99.8%，氨基酸序列相似性為97.0%～100.0%。

從GeneBank 數據庫中下載代表性毒株NA 蛋白氨基酸序列，對其活性中心、紅細胞結合位點和抗原決定簇區域關鍵氨基酸位點分析，結果見表4。

由表4 可知，NA 活性中心氨基酸序列比對發現，5 株分離株與經典型H1NISIV 參考毒株比較，在143 位和149 位氨基酸突變為K 和I；與類人H1N1SIV 株相比，在149 位和157 位氨基酸突變為I 和T；與類禽H1N1SIV 參考株在第155位氨基酸存在差異；在紅細胞結合位點上，分離株在369 位和第432 位氨基酸與類人H1N1SIV 株、人H1N1流感病毒參考毒株存在差異；抗原決定簇上，分離株與類禽H1N1SIV參考株一致，與其他參考毒株則均存在差異。

表4 分離株與參考株NA蛋白裂解位點與受體結合位點分析結果Tab.4 Analysis results of NA protein cleavage sites and receptor binding sites of isolates and reference strains

對分離株潛在糖基化預測結果顯示，存在5QKI7、83VKL85、216IKS218、346VKG348、362TKS364和431PKE4336 個 潛 在的糖基化位點，與類禽H1N1SIV 參考株一致，比其他參考株糖基化位點多，與A-Swine-Henan-01-2006（H1N1）株差異最大。

由圖2可知，通過MEGA 6.0進行系統發育分析顯示，5株分離株屬于類禽H1N1SIV分支。

2.3 內部基因遺傳進化分析（見圖3～圖8）

圖3 H1N1 SIV的PB2（A）基因的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PB2 (A) gene in H1N1 SIV

圖8 H1N1 SIV的NS（F）基因的系統發育分析Fig.8 Phylogenetic analysis of NS（F） gene in H1N1 SIV

5 株分離株的內部基因的核苷酸序列同源性依次為M 92.6%～99.8%、NP 97.3%～99.1%、NS 96.1%～98.1%、PA 97.7%～99.3%、PB1 97.1%～99.8%和PB2 96.8%～99.2%；氨基酸序列同源性依次為M 97.6%～100.0%、NP 98.2%～99.5%、NS 96.4%～98.7%、PA 96.4%～99.2%、PB1 97.5%～99.7%、PB2 97.2%～98.9%。

圖4 H1N1 SIV的PB1（B）基因的系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PB1 (B) gene in H1N1 SIV

圖5 H1N1 SIV的PA（C）基因的系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PA (C) gene in H1N1 SIV

圖6 H1N1 SIV的NP（D）基因的系統發育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of NP（D） gene in H1N1 SIV

圖7 H1N1 SIV的M（E）基因的系統發育分析Fig.7 Phylogenetic analysis of M（E） gene in H1N1 SIV

由圖3～圖8 可知，5 株分離株的內部基因中，PB2、PB1、PA、NP基因與人H1N1流感參考株遺傳關系最近。4 株分離株（LN972 株、LN975 株、LN995 株和LN1011 株）的M基因與類禽H1N1SIV 分支中A/swine/Hunan/30/2013（H1N1）參考株遺傳關系較近。而LN752 分離株與人H1N1流感參考株遺傳關系最近，NS基因與經典H1N1SIV 參考株處于同一個分支中。

3 討論

SIV于1930年初次從豬體內分離獲得[9]。感染SIV的豬呼吸道上皮細胞中存在SA-α-2,6-Gal（人）和SA-α-2,3-Gal（禽）等兩種受體，對人流感病毒和禽流感病毒的敏感性增強[10]，可同時感染禽流感病毒和人流感病毒，使不同流感病毒基因之間發生重新組合，從而突破種屬障礙，引起流感大流行。因此，豬也被認為是流感病毒的基因混合容器[11-12]。對SIV的研究不僅能夠減少SIV對養豬業也造成的損失，同時也具有重要的公共衛生學意義。

目前，針對遼寧地區豬群中SIV流行情況研究還不夠深入。本研究收集了近幾年從遼寧不同地區豬場收集的5株SIV毒株，在全基因測序的基礎上，對各個基因進行了系統分析。5株分離毒株裂解位點均僅含有1個堿性氨基酸（R），屬于低致病性流感病毒。由HA基因受體結合位點可知，分離株雖然與類禽型A/swine/Shanghai/1205/2017基本一致，但個別氨基酸位點出現突變，并且在133位氨基酸突變為K；分離株與人H1N1流感株在一位點氨基酸相同，可能預示病毒有利于與人類受體結合。分離株HA蛋白在190位氨基酸為D或V，225位氨基酸為E或G。有研究顯示，這類突變能夠在增加流感病毒由 SA-α-2,3-Gal 親和性轉變為SA-α-2,6-Gal 親和性中起關鍵作用，尤其E190D突變，在禽流感病毒適應哺乳動物宿主（豬和人）轉變中起到重要作用[13-14]。

由遺傳進化角度分析，分離株HA基因和NA基因與類禽型H1N1SIV 參考株親緣關系較近。潛在糖基化位點數量和位置變化不僅可能影響蛋白質的折疊、組裝和運輸等特性和功能，也會改變病毒的抗原性或增強病毒的流行性，從而有助于病毒逃避宿主免疫[15]。分離株HA 蛋白和NA 蛋白潛在糖基化位點也與類禽型H1N1SIV 參考株一致，但比經典型SIV 毒株潛在糖基化位點要多，可能增加了分離毒株結合受體的能力和病毒致病力。

研究表明，PB2 蛋白上的627 位和701 位氨基酸與A型流感病毒宿主范圍和病毒復制能力密切相關。本研究中，分離株在627位氨基酸位點為禽源性的627E，而701位氨基酸為人流感的701D，這有助于病毒在哺乳動物宿主內進行復制和傳播。分離毒株基因片段不僅與類禽H1N1SIV 同源性較高，部分基因片段與人H1N1流感病毒、河南和廣東等經典SIV毒株對應片段高度同源，提示分離株可能是在人流感病毒感染豬以及生豬跨區域流動過程中重組產生，應加強日常對SIV 主動監測。本研究中，通過對5株SIV毒株的分子特征和遺傳進化特性進行系統分析，結果顯示分離株具有類禽SIV和類人SIV的特征，可能具有感染人的能力。因此，無論從公共衛生安全還是從保障養豬業健康發展角度考慮，均應加強對SIV 的流行監測，密切關注我國豬群中SIV 流行情況，及時掌握其分子遺傳進化規律，對保障人類健康和降低養豬業經濟損失均具有十分重要的意義。

4 結論

本研究通過對遼寧地區5株SIV毒株進行分子特征及遺傳進化分析顯示，目前遼寧地區SIV流行毒株具有典型低致病性流感病毒的分子特征，但存在不同基因型流感病毒片段重組現象，應加強對SIV 的流行監測，減少對養豬業造成的損失以及由此引發潛在的公共衛生安全問題。