仔鹿感染綿羊鏈球菌、腸球菌的分離鑒定

王宏圖，張金江，冷 婧，趙穎婕，梁蓉蓉，胡建軍，敖維平*

（ 1. 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 阿圖什市動物衛生監督所，新疆 阿圖什 845350 ； 3. 塔里木大學人文學院，新疆 阿拉爾 843300 ）

塔里木馬鹿屬新疆馬鹿3 個亞種之一，屬于新疆特有動物物種資源。人工馴化飼養的塔里木馬鹿主要集中在新疆南疆部分農牧團場飼養繁育，仔鹿出生后，飼養管理不當、病原感染等因素可導致仔鹿發病，若治療不及時導致仔鹿死亡，對養鹿場造成一定經濟損失。鏈球菌的種類繁多、分布廣泛，常以共棲菌、致病菌的方式存在于大多數健康動物體內，主要有致病性、非致病性兩種類型。引起動物感染發病的主要是鏈球菌科中鏈球菌屬和腸球菌屬的一些成員，動物抵抗力低下時在多種誘因作用下可致動物發病，如各種化膿創、敗血癥等[1]。腸球菌原為鏈球菌屬的D 群成員，現屬于球菌綱、乳酸桿菌目、腸球菌科，是動物腸道內的一種正常菌群，為機會致病菌，可引起人畜共患的多種疾病如敗血癥、心內膜炎、腦膜炎以及尿路感染；在腸道內可作為轉移耐藥基因的供體菌，導致一些病原菌產生耐藥性，對疾病的治療造成困難[2-3]。2022年，新疆南疆某規模養鹿場仔鹿出現發病、死亡情況，給養殖場帶來了一定經濟損失。課題組對仔鹿發病情況進行了調查和采樣，通過實驗室檢測、分析，為該場疾病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

病料來自新疆南疆某規模化養鹿場發病仔鹿，無菌采集發病死亡鹿的肺臟、肝臟組織樣品，一份低溫保存，另一份保存在4%甲醛溶液。病料進行輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉黏膜病毒的抗原檢測，結果均為陰性。

1.1.2 試劑與儀器

腦心浸出液（BHI）肉湯、瓊脂粉等購自北京奧博星生物技術有限責任公司，抗菌藥物藥敏紙片（成套藥敏紙片）購自杭州微生物試劑有限公司，2×PCR Mix、Trans2K? DNA Marker均購自天根生化科技（北京）有限公司。

SHA-X 恒溫搖床（上海智勝分析儀器制造有限公司）、SW-CJ-IBU 超凈工作臺（上海博訊實業有限公司型號）、TC-5000 PCR 儀（Techne 有限公司）、麥氏比濁管（北京天安聯合科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病理組織學觀察

取4%甲醛溶液浸泡的肝臟組織，按照常規組織石蠟切片制作方法，切片染色、鏡檢，觀察組織病理變化。

1.2.2 細菌分離

無菌取肺臟、肝臟組織樣品劃線接種于BHI瓊脂培養基和脫纖維綿羊血瓊脂培養基，置37 ℃恒溫培養箱內培養18～20 h；挑取單菌落革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.3 生化試驗

分離株采用全自動微生物分析系統（VITEK 2 Compact）、革蘭氏陽性細菌鑒定卡進行生化鑒定。

1.2.4 PCR鑒定

細菌鑒定16S rRNA 通用引物，序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，擴增產物長度約為1 470 bp。

16S rRNA PCR 擴增反應體系（25 μL）：2×Taq PCR預混試劑Ⅱ 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR 擴增反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳，陽性PCR 產物送至上海派森諾生物有限公司測序。

1.2.5 CAMP試驗

在血瓊脂平板上以金黃色葡萄球菌作一橫線接種，垂直處用32T-1分離株接種一條線，兩線不相交且相距0.3～0.5 cm，37 ℃孵育18～24 h后觀察結果。

1.2.6 藥敏試驗

選取17 種臨床常用抗菌藥物，采用K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗，以抗菌藥物藥敏紙片試劑盒的判斷標準對試驗結果進行判定。

1.2.7 動物致病性試驗

利用麥氏比濁法將純化分離株培養18 h 后轉移到第一支試管中，制備成約5麥氏濁度的均一渾濁的菌懸液（約10 CFU/mL）。將15只小鼠隨機分為3組（試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、對照組），每組5只。試驗組分別接種兩個分離株的菌懸液300 μL，對照組接種等體積生理鹽水。觀察并記錄隨著時間的變化，小鼠的精神狀態及生理反應情況。

2 結果與分析

2.1 肝組織病理學觀察（見圖1）

由圖1可知，肝竇擴張充血，出現大量紅細胞，嗜中性粒細胞和灶性炎細胞浸潤，肝索變細、排列紊亂，小葉間結締組織變性、壞死及溶解。

圖1 肝組織病理學觀察Fig.1 Histopathological observation of liver

2.2 分離株革蘭氏染色鏡檢結果（見圖2）

由圖2（a）可知，綿羊血平板帶有β溶血環的菌落呈灰白色、不透明、表面光滑，革蘭染色陽性，無莢膜，呈球形鏈狀排列，直徑0.5～1.0 μm，命名為32T-1株。

由圖2（b）可知，菌落鏡檢可見部分呈橢圓短鏈狀排列的革蘭陽性菌，命名為32T-2株。

圖2 分離株革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Result of gram stain microscopic examination of isolates

2.3 CAMP試驗結果

結果顯示，金黃色葡萄球菌存在時，在兩接種線之間出現半圓狀的溶血區，產生了較明顯的β型溶血現象。

2.4 生化鑒定結果

結果顯示，分離株純培養物經全自動微生物分析系統（VITEK 2 Compact）檢測，32T-1 分離株與鏈球菌相似性達96%，32T-2分離株與腸球菌相似性達96%。

2.5 分離株PCR測序結果（見圖3～圖5）

圖3 分離株PCR檢測結果Fig.3 PCR detection results of isolates

由圖3可知，16S rRNA通用引物對分離株進行PCR擴增，得到與預期結果一致的1 470 bp的片段。

由圖4 可知，將32T-1 分離株測序結果與GenBank 中的基因序列進行比對分析，與綿羊鏈球菌參考株（GenBank登錄號：MT545017、MF326229、JQ411243、KE752835 等）核苷酸同源性達到99.8%以上，在系統進化樹上為同一分支。

圖4 32T-1分離株16S rRNA部分序列的核苷酸系統進化樹Fig.4 Nucleotide phylogenetic tree of 16S rRNA partial sequences of 32T-1 isolate

由圖5 可知，32T-2 分離株測序結果與腸球菌參考株（GenBank登錄號：OP881890、OP890221等）的核苷酸同源性達到99.8%以上。

圖5 32T-2分離株16S rRNA部分序列的核苷酸系統進化樹Fig.5 Nucleotide phylogenetic tree of 16S rRNA partial sequences of 32T-2 isolate

2.6 藥敏試驗結果（見表1）

由表1 可知，32T-1 分離株對哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、麥迪霉素、亞胺培南等敏感，對環丙沙星、頭孢唑啉、紅霉素中度敏感；對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢曲松、多西環素、克林霉素、復方新諾明等耐藥。

表1 藥敏試驗結果Tab.1 Drug sensitivity test

32T-2分離株對頭孢唑啉、哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、亞胺培南等敏感，對環丙沙星、麥迪霉素、多西環素、紅霉素、克林霉素中度敏感；對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢曲松、復方新諾明等耐藥。

2.7 動物試驗結果

結果顯示，接種32T-1 分離株的試驗Ⅰ組小鼠在24 h后出現死亡現象；試驗Ⅱ組接種32T-2分離株的小鼠出現精神不振、萎靡情況，48 h 后恢復正常，未出現死亡現象；對照組小鼠均未出現異常。

3 討論

本研究結果顯示，從發病死亡的仔鹿組織中分離到兩株革蘭陽性菌，經生化試驗、PCR鑒定、核苷酸同源性比較分析、動物致病性試驗等，確定分離菌株為β 溶血性綿羊鏈球菌、糞腸球菌，并且排除了輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉黏膜病毒的感染。

致病性鏈球菌可通過呼吸道、受損皮膚和黏膜等途徑進入動物機體。其中，β溶血性鏈球菌所產生的透明質酸酶有利于菌體在組織內擴散、蔓延，進入血液引起菌血癥。鏈球菌可感染多種動物，流行病學上的表現也多種多樣[1]。顏思通等[4]報道，一批進口羚羊、長頸鹿在檢疫期發病、死亡，經診斷為肺炎鏈球菌。鄧汝森等[5]報道，廣東省一規模化豬場突然發生散發性急性死亡，隨后經細菌的而分離鑒定、PCR 鑒定及生化鑒定等實驗室檢測，確定分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種。陳永林[6]對一例死亡鹿組織進行細菌分離鑒定，確定該鹿鏈球菌病病原為蘭氏C群鏈球菌。其他學者也開展了大量的鹿鏈球菌病診治研究工作[7-12]，為鹿鏈球菌病防治提供了寶貴的經驗。此外，國內也有多位學者開展了綿羊鏈球菌診治的研究報道[13-16]，為綿羊鏈球菌病治療積累了經驗。馮旭飛等[17]研究報道了西藏地區綿羊感染鏈球菌的情況，表明溶血性鏈球菌引起綿羊肺炎的病原菌之一。鏈球菌病作為人畜共患病對畜牧業造成的經濟損失已引起廣泛重視。

本研究分離獲得的一株β溶血性綿羊鏈球菌，通過動物致病性試驗表明該分離株具有強致病性。課題組在前期的流行病學調查中發現，該養鹿場飼養50余只綿羊，馬鹿與羊分欄飼養，但兩者相距較近。在發病死亡仔鹿體內分離到β溶血性綿羊鏈球菌，尚無法確定該病原是由羊傳染給仔鹿，還是仔鹿自身存在該菌。由于本研究缺乏羊群中致病性鏈球菌流行病學調查資料，因而需要進一步開展流行病學調查、相應檢測加以驗證。本研究結果也提示，鹿與羊在同一養殖場混養，勢必會增加動物疫病相互感染的風險。因此，在畜牧養殖過程中，不同物種混合飼養應該加強疫病防控意識。

腸球菌屬中的某些成員如糞腸球菌及屎腸球菌，普遍認為無致病性，甚至有些分離株還作為微生態制劑加以利用[1]。但人類的腸球菌可致院內感染，甚至在腸道中可轉移耐藥性基因而成為供體菌，攜帶的耐藥性基因可導致其他病原菌產生耐藥性，加大疾病治療難度[18]。本研究中所分離的腸球菌在動物致病性試驗中雖未表現出強致病性，但腸球菌可攜帶耐藥性基因作為供體菌應引起高度重視。

目前，養殖場普遍存在病原菌對抗生素產生耐藥性的問題。為提高疾病治療效果，本研究對分離株開展了藥敏試驗，篩選出哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、麥迪霉素、亞胺培南等敏感藥物，環丙沙星、頭孢唑啉、紅霉素等中度敏感藥物，但分離株對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢曲松、多西環素、克林霉素、復方新諾明等抗生素具有耐藥性。本試驗結果為當地養鹿場仔鹿疾病治療提供了參考。

4 結論

本研究結果表明，新疆南疆發病仔鹿存在β溶血性綿羊鏈球菌和腸球菌混合感染，病原鑒定、藥敏試驗為仔鹿疾病治療和預防提供了理論參考。