新疆阿克蘇地區某規模化豬場豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性分析

胡亞輝，張家浩，李 虎，劉祥杰，邢瀟月，楊睿智，李蓮瑞*

（ 1. 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ； 3. 新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ； 4. 塔里木大學生命科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ）

豬鏈球菌病是生豬養殖過程中較為常見的一類傳染性疾病，導致其發病的病原菌為豬鏈球菌。豬鏈球菌為革蘭氏陽性菌，在血平板培養基上可產生溶血環，呈圓形或橢圓形菌落[1]，時常與其他病原微生物混合感染，臨床防控較為困難，對我國豬養殖業造成了嚴重的經濟損失[2-4]。豬鏈球菌病在20世紀后期發病嚴重，在我國河北、河南等地區均呈地方性流行、大面積暴發[5-6]。豬鏈球菌主要通過呼吸道、消化道、傷口等途徑傳播流行，感染后主要寄居在扁桃體內，患病豬的體液、內臟等均存在大量鏈球菌[7]。豬感染后鏈球菌會導致腦膜炎等疾病，甚至使母豬流產，人感染后可能患敗血癥，出現腹瀉、腹痛等癥狀[8]。鏈球菌具有多種分型，主要有豬鏈球菌、馬鏈球菌中的類馬亞種和獸疫亞種以及傳統藍氏分群法（D、E、L 種群）鏈球菌等三大類[9]。通過血清學分型，按莢膜多糖抗原不同將鏈球菌分為不同類型，其中2型的致病性最強，病死率最高；目前可采用基因分型，即用多酶切位點電泳等技術進行分型，可表現出不同菌株之間的差異[10]。

新疆阿克蘇地區某豬場仔豬出現精神沉郁，采食量下降，呼吸困難和抽搐等臨床表現，部分仔豬死亡。解剖病死仔豬可見心臟、肝臟和脾臟存在病變，其他臟器無異常，懷疑感染豬鏈球菌。本試驗為確定其病原菌及其耐藥性，無菌采集該豬場仔豬病變臟器，進行細菌的分離培養，通過形態學觀察、生化試驗和16S rRNA序列分析進行鑒定，研究其耐藥性，為豬鏈球菌病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

解剖該豬場呼吸困難、抽搐的仔豬，無菌采集其內臟，編號后2 h 內冰浴運回實驗室，放于-4 ℃保存，用于分菌和進行藥敏試驗。

1.2 試劑與儀器

試驗試劑：膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、細菌微量生化鑒定管、DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），抗菌藥物藥敏紙片（杭州微生物公司），綿羊血瓊脂平板、Brain Heart Infusion（BHI）培養基（青島海博生物技術有限公司）等。

試驗儀器：Gel Doc TM XR+凝膠成像儀（Bio-RAD公司）；TC-5000PCR儀（英國TECHNE公司）、DYY-7C型穩壓穩流電泳儀（北京市六一儀器廠）、加熱制冷循環器（德國JULABO Laborteckmik G mbh）、HVE-50 高壓滅菌器（日本HIRAYAMA公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌的分離和純化

無菌挑取病死仔豬心臟、肝臟、脾臟病變組織，劃線接種于綿羊血瓊脂固體培養基上進行病原分離培養，37 ℃培養24～48 h 后選取形態不同的單菌落，多次劃線接種于BHI 固體培養基和綿羊血瓊脂固體培養基上進行純化。選取單一形態的單菌落，接種于BHI 液體培養基中增菌，用于保菌和DNA 提取。細菌形態學鑒定方法參考《伯杰細菌鑒定手冊》[11]。

1.3.2 分離菌的生化鑒定

按說明書將兩株分離株分別接種于山梨醇、甘露醇、水楊素、硫化氫、麥芽糖、棉籽糖、木糖、鳥氨酸和七葉苷等細菌生化培養管中，置于37 °C 恒溫培養箱，24 h后觀察生化鑒定結果。

1.3.3 分離菌的DNA提取及16S rRNA基因擴增

按照DNA 提取試劑盒說明書操作，提取DNA 保存于-20 ℃。對OD260/280檢測合格的DNA，參照文獻[12]合成細菌16S rRNA 基因通用引物（27F: 5' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；1 492R:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。預期擴增產物長度約為1 400 bp）進行擴增。

擴增體系：DNA模板1 μL、EasyTaq SuperMix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 0.5 min，56 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃ 10 min，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.3.4 PCR產物純化測序

按照膠回收試劑盒說明書進行操作，純化產物保存于-20 ℃。將PCR 純化產物送上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.3.5 分離菌16S rRNA同源性及進化樹分析

對所測得序列于NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）GenBank 數據庫中進行比對鑒定，采用軟件DNA star對所測的菌株做系統進化樹。

1.3.6 分離菌的藥物敏感性試驗

按照KB 紙片法，在MH 平板上37 ℃培養24～48 h，測量抑菌圈直徑（將紙片直徑計算在內），根據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的標準，判斷分離菌對17 種常用抗菌藥物的敏感情況。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離和純化（見圖1、圖2）

由圖1可知，綿羊血瓊脂固體培養基培養24 h，分離菌在培養基上呈圓形、隆起、半透明、光滑且濕潤、邊緣比較整齊的菌落，且存在β溶血環。

圖1 2型豬鏈球菌血平板溶血Fig.1 Hemolysis of Streptococcus suis serotype 2

由圖2 可知，分離菌株經革蘭染色鏡檢呈革蘭陽性單個、成對或長短不等鏈狀排列的球菌。綜上，初步判斷分離株為2型豬鏈球菌。

圖2 分離菌革蘭染色鏡檢結果Fig.2 Result of Gram staining microscopy

2.2 分離菌株的生化鑒定結果（見表1）

由表1可知，分離菌株可發酵水楊素、麥芽糖、七葉苷，不可發酵山梨醇、甘露醇、硫化氫、棉籽糖、木糖、鳥氨酸，結果符合豬鏈球菌的生化反應特性，將分離菌株命名為HY-SS2022。

表1 分離菌株生化鑒定結果Tab.1 Results of biochemical identification of isolated strains

2.3 分離菌株的16S rRNA擴增結果（見圖3）

分離菌株DNA 經核酸蛋白檢測儀檢測OD260/280值均在1.8～2.0之間，將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。

由圖3 可知，擴增條帶約為1 400 bp，與預計大小相同。

圖3 分離菌株的16S rRNA擴增結果Fig.3 16S rRNA amplification results of isolated strains

2.4 分離菌株的16S rRNA系統進化樹（見圖4）

由圖4可知，分離菌株HY-SS2022與GenBank中收錄的2 型豬鏈球菌同源性最高，均在95%以上，處于同一進化分支。

圖4 系統進化樹Fig.4 phylogenetic tree

結合分離菌的形態特征、生化特性及16S rRNA 基因序列比對結果，確定分離菌為2型豬鏈球菌。

2.5 分離菌株的藥物敏感性試驗結果（見表2）

由表2可知，分離菌株對頭孢哌酮、頭孢曲松鈉、多西環素、氧氟沙星及環丙沙星表現為敏感；對青霉素、阿米卡星、新霉素表現為中介；對阿莫西林、復方新諾明、氨芐西林、磺胺甲硝唑、四環素、米諾環素、紅霉素、慶大霉素、氯霉素和克林霉素表現為不同程度的耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果Tab.2 Results of drug sensitivity tests of isolated strains

3 討論

1945 年起，全世界范圍內開始陸續報道豬鏈球菌疫情[13]，以仔豬和母豬的患病率最高[14]。我國在1949 年，于上海郊區首次發現豬鏈球菌病，之后國內陸續有報道該病存在[15-18]。1951 年，荷蘭、英國等國家先后報道了豬鏈球菌病，其中1、2、7、9 型鏈球菌是致病性最高的病原[19-22]。1963 年，豬鏈球菌病在我國多個省份均有發生；1998 年至2020 年，我國豬鏈球菌病發病情況呈現不斷上升的趨勢，對我國的生豬養殖產業造成了嚴重的打擊，造成了一定經濟損失。

本試驗檢出的致病性2 型豬鏈球菌與國內大環境吻合，表明新疆阿克蘇地區已出現豬感染2型豬鏈球菌的情況。豬鏈球菌對環境耐受極高，四季均可發病，尤其每年的5 月至10 月傳播性最強。豬鏈球菌病多發生于氣候炎熱且潮濕的地區，具有地方流行性，潛伏期通常在1 周左右[23]。在規模養殖中若因人為或天氣原因導致飼養密度大、通風不良、室內空氣質量差均可增加感染概率[24]。豬鏈球菌病通常呈地方性流行，新疫區流行方式一般為暴發性，傳播迅速，危害極大；老疫區一般為散發性。

本試驗中，分離菌株對阿莫西林、復方新諾明、氨芐西林、磺胺甲硝唑、四環素、米諾環素、紅霉素、慶大霉素、氯霉素和克林霉素表現為不同程度的耐藥，表明該規模化養豬場存在抗生素過度使用的情況，尤其是四環素類抗生素，如多西環素、四環素和米諾環素。建議該場在了解抗生素耐藥情況后，合理使用抗生素，如使用頭孢哌酮、頭孢曲松鈉、多西環素、氧氟沙星及環丙沙星等較為敏感的藥物進行防治豬鏈球菌病。

4 結論

本試驗從新疆阿克蘇地區某規模化豬場病死仔豬體內分離到1株細菌，經細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗和16S rRNA序列鑒定，確定分離菌為2型豬鏈球菌。藥敏試驗表明，分離菌具有多重耐藥性，對四環素類、磺胺類、大環內酯類、氯霉素類等多種藥物表現為耐藥；對頭孢類藥物、諾氟沙星和氨芐西林表現為敏感。本研究結果可為防治該病的臨床合理用藥提供參考。