重組禽流感三價滅活疫苗免疫商品肉雞和蛋雞效果的研究

劉 超，陳生雷，佟 暉，曹祁峰，楊淑芳，鄭 鑫，侯芳芳，舒秀偉

（ 遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000 ）

禽流感（avian influenza，AI）是高度接觸性傳染性疾病，傳播途徑較為廣泛，由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起，可感染家禽、野鳥，也可感染哺乳動物甚至人類[1-4]。AIV 屬于A 型流感，根據表面HA 和NA 抗原性不同，分為若干亞型。目前從禽類已鑒定出15 個H 亞型，9 個NA 亞型[5-8]。根據致病性可分為高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI）。HPAI造成家禽較高的死亡率，被列為一類傳染病。截至目前，HPAI多為H5或H7亞型禽流感病毒感染所致[9-11]。

目前白羽肉雞養殖集約化程度較高，養殖周期短暫，生物安全及飼養管理水平均高于其他種類。蛋雞和三黃雞受到成本等因素影響，以家庭養殖場為主，規模為數萬只，養殖周期均較長，且生物安全措施低于白羽肉雞，更易暴露在AI 感染中。自2020 年12 月之后，國內AI 疫情頻發。作為防控AI 最重要的手段，疫苗免疫發揮了重要作用。免疫疫苗之后較短時間內產生抗體，可對機體產生保護。但受臨床中環境及生產性能等因素影響，免疫水平與實驗室SPF 雞存在較大差異[3]。本試驗為研究重組AI 疫苗免疫三黃雞和蛋雞的效果，監測完全臨床養殖中其抗體產生及消長規律，為進一步研究AI疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 疫苗

重組禽流感（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11+Re-12株、H7N9Re-3株，批號：21365050），記為疫苗A。

市售重組禽流感（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11+Re-12株、H7N9Re-3株，批號：2021017），記為疫苗B，由試驗養殖場提供。

1.1.2 檢測抗原

禽流感（H5N1Re-11株）檢測抗原（批號：2021002）、陽性血清（批號：2021001），禽流感H5N1Re-12 株檢測抗原（批號：2021002）、陽性血清（批號：2021001），禽流感H7N9Re-3 株檢測抗原（批號：2021004）、陽性血清（批號：2021002），均購自哈爾濱維科生物技術有限公司。

1.1.3 試驗動物

14日齡三黃肉雞40 000只，由廣東省江門市某養殖場提供并飼養。14日齡海蘭褐蛋雞20 000只，由遼寧省錦州市某養殖場提供并飼養。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

將40 000 只三黃肉雞分為A 組、B 組、C 組，其中A 組20 000 只，B 組19 900 只，C 組100 只。3 組分別于不同雞舍飼養。A 組與B 組分別免疫疫苗A 與疫苗B，C 組為不免疫對照組。2 周齡首免，頸部皮下注射，0.3 mL/羽份。6周齡進行二免，頸部皮下注射，0.5 mL/羽份[12-13]。

20 000 只蛋雞分為D 組、E 組、F 組，D 組10 000 只，E 組9 900 只，F 組100 只。3 組于不同雞舍飼養。D 組與E組分別免疫疫苗A與疫苗B，F組為不免疫對照組。2周齡首免頸部皮下注射，0.3 mL/羽份。6周齡進行二免，頸部皮下注射，0.5 mL/羽份。13周齡進行三免，頸部皮下注射，0.5 mL/羽份。

1.2.2 安全性評價

免疫后每天觀察試驗雞死亡、精神狀態、采食等狀況至試驗結束[14]。每次免疫后14 d隨機抽取10只免疫雞，觀察疫苗注射部位有無硬結、腫脹、潰爛等情況。待120日齡時，每組隨機抽取5 只雞，對照組隨機抽取5 只雞剖殺，觀察疫苗吸收情況。

1.2.3 抗體監測

1.2.3.1 采血及血清分離

各三黃肉雞組每組選擇15 只肉雞，分別于2（首免前）、4（首免后2 w）、5（首免后3 w）、6（二免前）、8（二免后2 w）、12（二免后6 w）、15（二免后9 w）、17（二免后11 w）周齡采血1.5～2.0 mL，3 000 r/min 離心10 min，血清于-20 ℃以下凍存。

各蛋雞組每組選擇15 只蛋雞，分別于2（首免前）、4（首免后2 w）、5（首免后3 w）、6（二免前）、8（二免后2 w）、11（二免后5 w）、13（三免前）、15（三免后2 w）、18（三免后5 w）、21（三免后8 w）、24（三免后11 w）周齡采血1.5～2.0 mL，3 000 r/min離心10 min，血清于-20 ℃以下凍存。

1.2.3.2 HI抗體測定

按照《中國獸藥典》附錄方法進行，分別測定禽流感H5N1Re-11 株、禽流感H5N1Re-12 株、禽流感H7N9Re-3株等3種抗體水平。

1.3 數據統計與分析

抗體水平數據采用Excel 軟件進行統計分析，采用graphPad軟件作圖。結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 安全性評價結果（見表1）

由表1可知，免疫后，A組與B組雞群精神狀態、采食、飲水等情況與C組無明顯差異；疫苗注射后14 d，隨機抽取10 只免疫雞檢查注射局部，均無腫脹、潰爛等異常情況發生。免疫后，D組與E組雞群精神狀態、采食、飲水等情況與F 組無明顯差異；疫苗注射后14 d，隨機抽取10 只免疫雞檢查注射局部，均無腫脹、潰爛等異常情況發生。

表1 安全性評價Tab.1 Evaluation of safety

120 日齡時，A 組死淘12 只（死淘率0.06%），B 組死淘13 只（死淘率0.07%）；各組隨機抽取5 只雞剖殺觀察疫苗吸收情況，A組疫苗已全部吸收，B組疫苗有1只可見小顆粒。120 日齡時，D 組死淘28 只（死淘率0.28%），E 組死淘26 只（死淘率0.26%）；各組隨機抽取5 只雞剖殺觀察疫苗吸收情況，D組疫苗已全部吸收，E組疫苗有1只可見完全吸收的小顆粒。

綜上所述，市售重組禽流感疫苗安全性評價較好，吸收方面疫苗A略好于疫苗B。

2.2 抗體監測結果

2.2.1 三黃雞免疫后抗體水平消長情況（見表2）

表2 三黃雞免疫后抗體水平消長情況Tab.2 Decline of antibody level in Sanhuang chickens after immunization單位：log2

由表2 可知，首免2 周后，機體即可產生抗體，免疫后3 周達到高峰值，此時母源抗體下降至2 log2 以下，4 周后抗體略有下降。二次免疫后抗體迅速上升，HI抗體均達到8.5 log2以上，且維持時間2個月以上（抗體大于8 log2）。

不同疫苗HI抗體水平比較，使用A疫苗免疫組的三黃雞H5/Re-11 與H7/Re-3 抗體水平比B 疫苗高0.5～1.0 個滴度；使用兩種疫苗免疫的雞H5/Re-12抗體水平相當。結果表明，三黃雞免疫2 種疫苗后3 周，3 種抗體水平即可達到6 log2 以上；二次免疫至出欄時，抗體平均值在8 log2 以上，可以產生100%保護。

2.2.2 蛋雞免疫后抗體水平消長情況（見表3）

由表3可知，首免2周后，機體內HI抗體在5.5 log2以上，3周后達到高峰值（6 log2以上），4周后抗體開始下降。二次免疫2 周后，抗體迅速上升，達到9 log2 以上，且維持時間5周（7 log2以上）。三免后抗體水平，3種抗體均大于10 log2，維持時間約9周。

表3 蛋雞免疫后抗體水平消長情況Tab.3 Decline of antibody level in laying hens after immunization單位：log2

與三黃肉雞類似，使用A疫苗免疫組的蛋雞H5/Re-11與H7/Re-3抗體水平比B疫苗高0.3～1.0個滴度；使用兩種疫苗免疫的雞H5/Re-12抗體水平相當，疫苗A略好于疫苗B。結果表明，蛋雞首次免疫后3 周，H5/Re-11、H5/Re-12、H7/Re-3等3種抗體即可達到6 log2以上，免疫3次后到產蛋高峰之前（150 日齡），HI 抗體大于8 log2，可以產生100%保護。

綜上所述，對于養殖周期較長的蛋雞和三黃雞，免疫兩次商品化禽流感三價滅活疫苗后，HI抗體均達到9 log2以上，且維持至120 d 以上，可到達保護水平。2～3 次免疫后基本無殘留。不同廠家疫苗抗體水平有所差異。

3 討論

禽流感是嚴重危害我國養雞業的疫病之一，禽流感疫苗在該病的防控中發揮了不可替代的作用。免疫后抗體水平是評價免疫是否成功的主要指標，但受到養殖場環境、母源抗體、疫苗質量等因素影響，商品雞與SPF雞免疫禽流感疫苗后，抗體水平差別較大。為了解禽流感疫苗在臨床中的使用情況，本研究分別使用不同廠家的免疫禽流感疫苗對三黃肉雞與商品蛋雞進行免疫，并評價了其安全和效力。

試驗結果顯示，首次免疫后，三黃肉雞H5/Re-11 抗體達到5.0 log2以上，H5/Re-12抗體約6.0 log2，H7/Re-3抗體可達到5.5 log2以上，4周后開始下降。二次免疫后抗體水平上升約3個滴度，持續期可達近2個月。結果表明，免疫商品禽流感三價滅活疫苗可以對雞群產生較高水平的保護，不同廠家疫苗效果略有不同，使用A 疫苗免疫的雞群H5/Re-11與H7/Re-3抗體水平比B疫苗高0.5～1.0個滴度。三黃肉雞養殖周期約3～4個月，進行2次免疫，抗體可以達到保護水平（HI＞6 log2）。

商品蛋雞監測結果與三黃肉雞類似，使用A疫苗免疫的雞群H5/Re-11與H7/Re-3抗體水平比B疫苗提高了0.3～1.0個滴度。商品蛋雞開產前一般免疫3～4次，本試驗分別于2、6、13周齡進行3次免疫，使開產至高峰前產蛋維持在7～9 log2 之間，產蛋上升期間，抗體水平下降較快，建議高峰前進行1次免疫。

通過上述試驗可知，目前商品禽流感三價滅活疫苗免疫蛋雞和肉雞后，可以產生較高HI抗體水平，且維持時間較長，在一定意義上防控了高致病性禽流感在家禽中的傳播。近年來家禽發生高致病性禽流感的報道較少，與家禽免疫禽流感疫苗的研發與使用具有很大關聯，應進一步加強相關免疫政策執行力度或落實相關免疫政策。

4 結論

本研究結果表明，三黃肉雞經過兩次免疫禽流感，抗體達到6 log2以上，可以保護機體不受感染。商品蛋雞開產前三次免疫后，開產前至產蛋高峰維持在7～9 Log2，但下降較快。綜上所述，肉雞出欄前（120 d）免疫禽流感疫苗2次，蛋雞開產前免疫3次，可防護禽流感的感染。