槲皮苷對(duì)PCV2 感染豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

易首利，韋玉衡，趙 怡，匡 娜，曹永強(qiáng)，胡庭俊

（ 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005 ）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一。目前發(fā)現(xiàn)PCV有4個(gè)血清型，即豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒Ⅲ型（PCV3）和豬圓環(huán)病毒Ⅳ型（PCV4）。PCV2為致病性的病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原[1]。隨著養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，PCV2 病毒已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，通過(guò)水平傳播和垂直傳播兩種方式在豬群中流行，對(duì)豬群造成持續(xù)性危害[2]，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

黃酮類化合物是一類存在于天然物質(zhì)中具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物，屬于植物次生代謝產(chǎn)物[3]。大量研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化及抗癌等特性[4-5]。辣蓼的主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油、糅質(zhì)類等，其中黃酮類化合物具有生物抗氧化性、清除自由基、殺蟲等多種生物活性[6]。辣蓼黃酮主要含有蘆丁、槲皮素和槲皮苷等物質(zhì)[7-8]。槲皮苷（quercitrin，QUE）具有多種治療作用，包括抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)血脂及抗氧化等[9]。有研究結(jié)果顯示，QUE 具有抗過(guò)敏作用，可減輕特應(yīng)性皮炎[10]。董金葉等[11]發(fā)現(xiàn)，QUE可以通過(guò)減少吞噬細(xì)胞的數(shù)量減輕局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步減輕小鼠變應(yīng)性鼻炎的癥狀。Kim 等[12]發(fā)現(xiàn)，QUE 通過(guò)刺激NADPH 的產(chǎn)生和線粒體膜電位增強(qiáng)真皮乳頭細(xì)胞中的細(xì)胞活力和能量代謝，促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)。Tang 等[13]發(fā)現(xiàn)，QUE 可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激。目前PCV2流行毒株變異較快，尚無(wú)較好的方法能夠完全控制該病的發(fā)生。本試驗(yàn)采用中性紅法測(cè)定QUE 對(duì)3D4/2 細(xì)胞吞噬活性的影響以及QUE 對(duì)感染PCV2 的3D4/2 細(xì)胞吞噬活性的影響，確定QUE 能否提高3D4/2 細(xì)胞的吞噬活性，并對(duì)其產(chǎn)生保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑

QUE（純度98%）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，DMEM 粉末高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，青霉素、鏈霉素混合液（100×）、L-Glutamine、PBS緩沖液、二甲基亞砜（DMSO）、中性紅粉末購(gòu)自索萊寶公司，胰蛋白酶EDTA溶液購(gòu)自BI公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

多功能微孔板檢測(cè)儀（瑞士TECAN 公司）、熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀（美國(guó)NEXCELOM公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER 公司）、TS100-F 倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.1.3 病毒和細(xì)胞

PCV2毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷與免疫實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)獲得病毒液，根據(jù)Reed-Muench方法測(cè)量其病毒滴度（TCID50）為10-5/0.1 mL。

豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/2 細(xì)胞來(lái)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增培養(yǎng)獲得，定期復(fù)蘇細(xì)胞保存活力，并于液氮中凍存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 QUE 對(duì)3D4/2細(xì)胞吞噬活性的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3D4/2 細(xì)胞用10%-FBS-DMEM培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，按照100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后取出96 孔板，棄去培養(yǎng)液，按照100 μL/孔加入新鮮的2.5%-FBS-DMEM 完全培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

試驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、0.05% DMSO 組和不同濃度的QUE 藥物組（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L，以2.5%-FBS-DMEM 培養(yǎng)液稀釋），每組6 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞對(duì)照組、0.05% DMSO 組每孔加入200 μL 2.5% FBSDMEM 培養(yǎng)液，藥物組每孔加入200 μL 不同濃度的槲皮苷，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

培養(yǎng)結(jié)束前1 h，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，每孔分別加入0.072%中性紅溶液100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h。取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄掉中性紅溶液，加入PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，吸取150 μL細(xì)胞裂解液分別加入每孔中，混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀540 nm處下測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞吞噬指數(shù)。

1.2.2 QUE對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞吞噬活性的影響

試驗(yàn)設(shè)置為細(xì)胞對(duì)照組、0.05% DMSO 組、PCV2陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度的QUE 藥物組（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、 400.0 μmol/L，含2.5%-FBS-DMEM 培養(yǎng)液稀釋），每組6 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞對(duì)照組、0.05% DMSO 組每孔加入100 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，PCV2陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度QUE 組加入PCV2（感染復(fù)數(shù)MOI=1）病毒液100 μL孵育2 h，用無(wú)菌PBS洗滌后，細(xì)胞對(duì)照組和對(duì)照組每孔分別加入200 μL 含2.5%-FBS-DMEM 培養(yǎng)液，QUE 組每孔加入200 μL 不同濃度的QUE 溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)36 h。按照1.2.1中的中性紅法測(cè)定其OD值，并計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 23軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 QUE對(duì)3D4/2細(xì)胞吞噬活性的影響（見(jiàn)表1）

由表1 可知，與對(duì)照組相比，0.05% DMSO 組、12.5 μmol/L QUE 組對(duì)3D4/2 細(xì)胞吞噬指數(shù)無(wú)顯著增強(qiáng)作用（P＞0.05）；25.0、50.0 μmol/L 的QUE 處理后顯著提高了3D4/2細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.05）；經(jīng)100.0～400.0 μmol/L的QUE處理后極顯著提高3D4/2細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.01）。

表1 QUE對(duì)3D4/2細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響Tab.1 Effect of QUE on 3D4/2 cell phagocytosis index 單位：%

2.2 QUE 對(duì)PCV2 感染3D4/2 細(xì)胞吞噬活性的影響（見(jiàn)表2）

表2 QUE對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響Tab.2 Effect of QUE on phagocytic index of PCV2-infected 3D4/2 cells單位：%

由表2可知，PCV2感染3D4/2細(xì)胞36 h后略下調(diào)細(xì)胞的吞噬指數(shù)，但與細(xì)胞對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；含有0.05% DMSO 的溶劑對(duì)細(xì)胞吞噬指數(shù)也無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與PCV2 陽(yáng)性對(duì)照組相比，不同濃度的QUE（12.5～400.0 μmol/L）處理36 h后均能夠極顯著提高PCV2感染3D4/2 細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，100、200、400 μmol/L 的QUE 極顯著提高細(xì)胞吞噬指數(shù)（P＜0.01）。

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，屬植物次生代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞吞噬活性有一定影響，具有免疫調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老細(xì)胞、殺滅外源性抗原及抗原提呈等作用[14]。巨噬細(xì)胞是一把雙刃劍，在多種疾病中具有雙重作用，是促發(fā)先天免疫的炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，通過(guò)分化、極化、激活等方式，對(duì)多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制起到?jīng)Q定性作用[15]。PCV2通過(guò)口鼻腔、呼吸道等途徑感染天然宿主（家豬和野豬），病毒在宿主體內(nèi)持續(xù)性復(fù)制增殖，誘導(dǎo)具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)一步降低宿主細(xì)胞非特異性免疫功能，嚴(yán)重侵害患豬的免疫系統(tǒng)，形成免疫抑制。豬肺泡巨噬細(xì)胞通常被認(rèn)為是PCV2 感染的重要靶細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御有害物質(zhì)的第一道防線。吞噬活性增強(qiáng)是肺泡巨噬細(xì)胞活化的典型特征，也是衡量機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。中性紅法常用于檢測(cè)免疫細(xì)胞的胞飲吞噬能力，其細(xì)胞數(shù)量的多少?zèng)Q定中性紅的積累，與細(xì)胞胞飲吞噬活性呈正相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黃酮類化合物均可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫功能[16-18]。苦蕎糠皮總黃酮可使小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)，且吞噬指數(shù)呈劑量依賴性增加[19]。楊秀松[20]發(fā)現(xiàn)，金花葵粗黃酮提取物可以增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分率、單核吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)。橙皮素衍生物通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的釋放，同時(shí)上調(diào)Bcl-2和Bcl-XL 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)免疫力，從而參與免疫反應(yīng)[21]。上述結(jié)論與本試驗(yàn)中QUE增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性的結(jié)果相一致。

本研究通過(guò)中性紅試驗(yàn)檢測(cè)3D4/2 細(xì)胞吞噬活性，結(jié)果表明，DMSO溶劑、12.5 μmol/L QUE對(duì)細(xì)胞吞噬指數(shù)無(wú)顯著作用，即對(duì)吞噬活性無(wú)影響；25.0～400.0 μmol/L 的QUE顯著提高細(xì)胞的吞噬指數(shù)，即增強(qiáng)其吞噬活性；12.5～400.0 μmol/L的QUE均能極顯著提高PCV2感染3D4/2細(xì)胞的吞噬指數(shù)，即對(duì)其吞噬活性具有明顯的增強(qiáng)作用，且吞噬活性隨著藥物濃度升高而增強(qiáng)。綜上所述，QUE能夠促進(jìn)豬肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬活性，并具有一定的保護(hù)作用，可增強(qiáng)細(xì)胞的免疫活性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，QUE可以顯著提高3D4/2細(xì)胞吞噬中性紅染料的能力，即QUE 提高3D4/2 細(xì)胞的吞噬活性，表明QUE 對(duì)3D4/2 細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用與免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)其吞噬活性具有良好的促進(jìn)作用。