通俗環(huán)毛蚓、參環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓的分子鑒定及纖溶、抗凝活性對比

楊麒琳，馬韞楠，楊萬青，汪文杰，鐘宛凌，樊簫雨，楊天姿，杜守穎，李鵬躍（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029）

2020年版《中國藥典》收錄的地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgarisChen（P. vulgaris）、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥體[1]。前一種習(xí)稱“廣地龍”，主產(chǎn)地為廣東、廣西、海南等；后3種習(xí)稱“滬地龍”，主產(chǎn)地為上海、江蘇、浙江等[2]。我國地龍藥材的基原動物主要有14個品種，分別屬于鉅蚓科（Megascolec-idae）、正蚓科（Lmubricidae）和鏈胃蚓科（Moniligastridae）5 個屬[3]。赤子愛勝蚓Eisenia foetida（Savigny）為正蚓科愛勝蚓屬，俗稱紅蚯蚓，其繁殖率高，適宜人工養(yǎng)殖，是目前世界上養(yǎng)殖最普遍的蚯蚓品種[4]。地龍及混淆品的基原動物種類繁多，且形態(tài)極其相似，容易造成品種混雜和摻假的現(xiàn)象[5]。通過 DNA 分子水平進行物種的鑒別是近年來興起的物種鑒定新方法，在中藥材鑒定領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。格小光等[6]采集全國多個藥材市場的地龍，進行 DNA分子鑒定，與數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn) 55% 的市售地龍均非藥典規(guī)定的基原。因此采用 DNA 分子鑒定地龍是有效的手段。

現(xiàn)代研究表明，地龍中含有的化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷、有機酸、脂質(zhì)等[7]，其中地龍內(nèi)含有的蛋白多肽類成分高達(dá) 55%～68%[8]。目前有關(guān)赤子愛勝蚓的研究大多集中在其對環(huán)境污染物的富集、生物降解等方面[9]。而赤子愛勝蚓不僅在環(huán)境保護方面發(fā)揮功能，同時也是一種有效的抗血栓藥材。赤子愛勝蚓是藥典地龍品種之外研究抗血栓活性較多的蚯蚓品種。20世紀(jì) 80年代日本學(xué)家 Mihara[10]首次從赤子愛勝蚓中分離得到具有纖溶酶活性的蛋白酶，后來研究者們開始研究蚯蚓具有抗血栓功效的蛋白多肽類成分，發(fā)現(xiàn)地龍蛋白中的纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶對體內(nèi)凝血系統(tǒng)具有顯著的影響，是抗凝血活性物質(zhì)的主要成分[11]。乙醇沉淀法是純化蛋白常用方法，是利用蛋白的溶解度進行分離純化，彭洪兵等[12]對比鹽析法和水提醇沉法對地龍蛋白活性的影響，結(jié)果表明水提醇沉法的蛋白提取率及纖溶活性均高于鹽析法。因此本實驗選擇藥典內(nèi)的滬地龍品種之一通俗環(huán)毛蚓和廣地龍的品種參環(huán)毛蚓與藥典外的赤子愛勝蚓，對比這3種蚯蚓水提液以及乙醇沉淀物的抗血栓活性大小，為今后地龍抗血栓類產(chǎn)品的開發(fā)選擇蚯蚓品種提供參考。

1 材料

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（PHGT-9140A），臺式高速離心機（5418 R，Eppendorf），超微量分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo），PCR儀（C1000，Bio-Rad）、電泳儀（PowerPac，Bio-Rad），凝膠成像儀（UVP，Upland），微量移液器（Eppendorf），Milli Q 超純水機（Millipore），pH計（FE20，Mettler Toledo），恒溫空氣浴搖床（INNOVA 40R，New Brunswick），勻漿機（QSJ1 型，OIDIRE），電動攪拌器（OES20 型，BNCH），臺式離心機（TDL80-2B 型，上海安亭科學(xué)儀器廠），Multiscan Go 全波長酶標(biāo)儀（Thermo Scientific），電子天平（BS224S 型，Sartorius），Sysmex CA500 全自動血凝分析儀（Sysmex）。

鮮體通俗環(huán)毛蚓（上海市地龍養(yǎng)殖基地），鮮體赤子愛勝蚓（天津市蚯蚓培養(yǎng)基地），鮮體參環(huán)毛蚓（廣西蚯蚓養(yǎng)殖基地），基因組提取試劑盒Mollusc DNA Kit D3373（OMEGA Bio-tek，America），F(xiàn)ast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、5minTM TA /Blunt-Zero Cloning Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、Fast-T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞C505-02/03（Vazyme，南京諾唯贊生物科技有限公司），無水乙醇（Fisher），氯仿（北京科華經(jīng)緯科技有限公司），異戊醇（X1，西隴化工股份有限公司），氯化鈉、氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），Tris、EDTA（Bioruler，America），冰醋酸（北京化工股份有限公司），Tryptone、Yeast Extract（OXOID），瓊脂糖（Biowest Agarose，北京拜爾迪生物有限公司），6x SuperStain Loading Buffer（北京康為試劑生物科技有限公司），Agar粉（北京索萊寶科技有限公司），氨芐青霉素鈉（北京百瑞極生物科技有限公司），COI通用引物（COI-F：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，COI-R：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，Tm 值為 54），纖維蛋白原（牛血）（批號：140607-202042）、凝血酶（牛血）（批號：140606-201826）、蚓激酶（批號：140650-201703）（中國食品藥品檢定研究院），生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號：SD21061115），瓊脂糖（上海貝晶），藥用級95%乙醇。

2 方法

2.1 3種蚯蚓的分子鑒定

2.1.1 蚯蚓DNA的提取 在研缽中放入活體蚯蚓2 cm的肌肉組織，加入液氮冷凍，快速研磨成粉，按照軟體動物基因組提取試劑盒（Mollusc DNA Kit D3373）說明書提取蚯蚓基因組 DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并通過NanoDrop 2000 進行濃度及純度檢測。

2.1.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 根據(jù)PCR擴增試劑盒（Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit）說明書加入通用引物、DNA 和試劑，PCR的反應(yīng)程序以50 μL反應(yīng)體系建立，具體程序見表1。1% 瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，將擴增產(chǎn)物連接至質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌，將菌液送華大基因進行測序。測序完成后，將克隆的基因片段在National Center for Biotechnology Information（NCBI）中進行 BLAST 搜索比對。

表1 PCR反應(yīng)程序Tab 1 PCR reaction procedure

2.2 3種蚯蚓水提液及乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對比

2.2.1 3種蚯蚓水提液的制備 將鮮體蚯蚓切碎，用打漿機制成蚯蚓泥，加4倍量純水，勻漿處理，離心（4000 r·min-1，15 min），收集上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測范圍內(nèi)作為測試樣品。

2.2.2 3種蚯蚓乙醇沉淀物的制備 取鮮體蚯蚓制備的水提液，加定量 95% 乙醇，調(diào)至乙醇濃度為80%，靜置后收集沉淀，凍干。稱取 10 mg 乙醇沉淀物加 10 mL 生理鹽水溶解，稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測范圍內(nèi)作為測試樣品。

2.2.3 纖維蛋白平板法評價纖溶活性 參考劉濤等[13]利用纖維蛋白平板法，以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品測定地龍中蛋白酶的活性，本實驗采用蚓激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品。取一次性平皿，加入0.5 mL凝血酶（40 BP·mL-1）。將8 mL纖維蛋白原（2 mg·mL-1）與10 mL的瓊脂糖溶液（5 mg·mL-1）迅速混合后加入皿中，輕輕搖勻，室溫水平放置1 h后打孔，分別吸取10 μL濃度為4000、6000、8000、10 000、12 000、16 000 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶以及“2.2.1”項下制得的測試樣品進行點樣加蓋，置37℃恒溫箱中孵育18 h，取出，測量溶圈垂直兩直徑，以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶單位數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，垂直兩直徑乘積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制回歸方程，計算樣品效價單位數(shù)作為纖溶活性，利用公式1計算纖溶比活（U·μg-1）。

公式 1：纖溶比活（U·μg-1）＝纖溶活性（U·mL-1）/蛋白濃度（μg·mL-1）

2.2.4 Fibg-TT法評價抗凝活性 參考吳婭麗等[14]利用全自動血凝分析儀測定纖維蛋白原-凝血酶時間（Fibg-TT）來評價地龍及其相關(guān)制劑的體外抗凝活性。以生理鹽水為空白對照，測定系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶液（250、500、1000、1500、2000 U·mL-1）和測試樣品，以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶的單位數(shù)為橫坐標(biāo)，以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶 Fibg-TT 的對數(shù)與空白組 Fibg-TT 的對數(shù)的差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品效價單位數(shù)作為抗凝活性，利用公式 2 計算抗凝比活（U·μg-1）。

公式2：抗凝比活（U·μg-1）＝抗凝活性（U·mL-1）/蛋白濃度（μg·mL-1）

2.3 蛋白含量測定

采用BCA法測定蚯蚓蛋白含量，測試樣品用酶標(biāo)儀進行測定，以系列濃度BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量。

2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

采用 SDS-PAGE檢測3種蚯蚓乙醇沉淀物的分子量，每個樣品上樣 10 μL。采用 12% 電泳預(yù)制膠，電壓為 150 V，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液染色，最后用純水脫色至背景清晰，重復(fù)2次。

2.5 數(shù)據(jù)處理

每種蚯蚓從提取到測試重復(fù) 3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3種蚯蚓的分子鑒定結(jié)果

3.1.1 蚯蚓 DNA 的提取、PCR 擴增 對3種蚯蚓提取的 DNA 進行瓊脂糖電泳檢測，DNA 條帶均清晰明亮，無彌散情況，如圖 1。3種蚯蚓提取的 DNA 的A260/280均在 1.8～2.0，表明提取的DNA 純度較高，無蛋白質(zhì)污染。利用通用引物COI對3種蚯蚓提取的 DNA 片段進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物的條帶均呈現(xiàn)整齊、單一明亮的條帶，如圖 2。

圖1 3種蚯蚓提取的 DNA 的瓊脂糖電泳Fig 1 Agarose electrophoresis of DNA of the three earthworms

圖2 3種蚯蚓 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳Fig 2 Agarose electrophoresis of PCR products of the three earthworms

3.1.2 PCR 產(chǎn)物測序分析 去除載體 TOPO 序列及引物端可知擴增的COI基因片段大小分別是：參環(huán)毛蚓為 709 bp、赤子愛勝蚓為 768 bp、通俗環(huán)毛蚓為 765 bp。BLAST 相似性比對結(jié)果顯示本實驗3種蚯蚓都能成功匹配上對應(yīng)物種。其中本實驗樣品通俗環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫中報道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為通俗腔蚓（Metaphire Vulgaris）線粒體基因COIKF205980.1，相似度為 99.27%。通俗腔蚓與通俗環(huán)毛蚓為同名異物現(xiàn)象，該現(xiàn)象是由于蚯蚓分類系統(tǒng)的改進而出現(xiàn)的結(jié)果[15]。本實驗樣品赤子愛勝蚓與 NCBI 基因庫中報道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）線粒體基因COILC006114.1，相似度為98.87%。本實驗樣品參環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫中報道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為參環(huán)毛蚓（Pheretima aspergillum）線粒體基因COIMN729554.1，相似度為 99.85%。

3.2 3種蚯蚓水提液的纖溶、抗凝活性對比

計算3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比，具體結(jié)果如表 2 所示。3種蚯蚓的水提液纖溶比活用單因素方差分析檢驗，LSD 法進行兩兩比較，F(xiàn)＝1753.750，P＜0.05；3種蚯蚓的水提液抗凝比活用單因素方差分析檢驗，LSD 法進行兩兩比較，F(xiàn)＝274.35，P＜0.05。因此3種蚯蚓水提液的纖溶比活之間與抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示參環(huán)毛蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活最強，通俗環(huán)毛蚓次之，赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓，而赤子愛勝蚓水提液的蛋白含量最高。

表2 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n＝3)Tab 2 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of water extracts from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對比

3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比結(jié)果見表 3。3種蚯蚓的乙醇沉淀物纖溶比活用單因素方差分析檢驗，LSD 法進行兩兩比較，F(xiàn)＝1053.967，P＜0.05；3種蚯蚓的乙醇沉淀物抗凝比活用單因素方差分析檢驗，LSD 法進行兩兩比較，F(xiàn)＝127.904，P＜0.05。因此3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶比活之間和抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強，通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強，赤子愛勝蚓的纖溶比活、抗凝比活、蛋白含量均小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓。

表3 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n＝3)Tab 3 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of ethanol precipitates from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.4 SDS-PAGE 結(jié)果分析

重復(fù)2次結(jié)果一致性較好，典型圖譜見圖3，通俗環(huán)毛蚓與參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的條帶集中在25～70 kDa，但條帶分布有所差異，而赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的條帶集中在 25～40 kDa，條帶數(shù)量較前兩種蚯蚓少。其中參環(huán)毛蚓乙醇分級沉淀物在 55～70 kDa分布一個較為清晰的條帶，通俗環(huán)毛蚓乙醇分級沉淀物在 25～35 kDa 分布一個較為清晰的條帶。3種蚯蚓的乙醇分級沉淀物均在 10～15 kDa 有一條較寬的條帶。

圖3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的 SDS-PAGE 圖Fig 3 SDS-PAGE of ethanol precipitates from three earthworms

4 討論

雖然形態(tài)鑒定是傳統(tǒng)鑒定方法，但地龍的外表形態(tài)特征相似，僅通過形態(tài)鑒定無法確定品種，容易受主觀因素影響，且混雜品種較多，采用 DNA 分子鑒定可以更準(zhǔn)確、高效地鑒定地龍品種。本實驗運用基于COI基因?qū)︴r體地龍進行DNA 分子鑒定，序列結(jié)果與 NCBI 中的基因庫對比，與已知地龍品種的序列相似度均在 98% 以上，以此相似度可確定品種，有效鑒定出參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓。

不同地龍含有的抗血栓活性蛋白有所區(qū)別，抗血栓的能力也有差別。本研究結(jié)果表明，參環(huán)毛蚓的水提液抗凝比活和纖溶比活最強；參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強，而通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強；赤子愛勝蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝比活和纖溶比活都遠(yuǎn)小于前兩者。赤子愛勝蚓中發(fā)揮抗血栓作用的主要是蚓激酶，這說明藥典內(nèi)的兩種地龍體內(nèi)含有除蚓激酶之外獨特的蛋白，其具有較高的抗血栓活性。通過縱向?qū)Ρ龋球疽掖汲恋砦锏目鼓然钆c纖溶比活均強于蚯蚓的水提液，可知通過乙醇沉淀法可以有效純化富集抗血栓地龍蛋白。

參環(huán)毛蚓的水提液抗凝活性更強，而通俗環(huán)毛蚓的乙醇沉淀物抗凝活性更強，可能因為通俗環(huán)毛蚓水提液中含有非抗凝血蛋白和非蛋白物質(zhì)含量較高，且雜蛋白中可能有促凝血的蛋白，用乙醇純化后，去除了部分雜質(zhì)，使得通俗環(huán)毛蚓中抗凝蛋白能更充分地發(fā)揮其作用。同時也說明地龍蛋白是主要具有抗凝活性的物質(zhì)，且純度越高作用越明顯。赤子愛勝蚓用水提取后的蛋白含量在三者間最高，再用乙醇純化后蛋白含量反而最低，推測赤子愛勝蚓體內(nèi)含有大量非抗血栓活性蛋白和非蛋白物質(zhì)，或者用乙醇純化赤子愛勝蚓蛋白效率較低，應(yīng)該另尋找更適合的純化方法。

3種蚯蚓乙醇沉淀物在 25～40 kDa 均有較明顯的條帶，說明地龍具有抗血栓活性的獨特蛋白分子量分布于此，但條帶分布有明顯差異，說明3種蚯蚓中具有抗血栓活性蛋白有所差異。

從本研究結(jié)果可看出，藥典內(nèi)的兩種蚯蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝活性和纖溶活性都遠(yuǎn)強于赤子愛勝蚓，而目前研究較多的是藥典以外的蚯蚓品種（赤子愛勝蚓、粉正蚓）等，關(guān)于藥典內(nèi)的地龍研究較少，且通俗環(huán)毛蚓和參環(huán)毛蚓分布廣，數(shù)量多，因此深入研究藥典內(nèi)地龍的基原蚯蚓的抗血栓活性蛋白具有重大意義。本實驗僅研究了3種蚯蚓水提液和乙醇沉淀物的纖溶和抗凝活性，后續(xù)可進一步純化參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓蛋白的抗血栓活性部位，研究其體內(nèi)外的活性及物質(zhì)基礎(chǔ)。