半邊旗二萜化合物5F對人結直腸癌細胞增殖、凋亡和自噬的影響

羅夢花，陳佩文，陳志紅，吳民華，龔先玲*（. 廣東醫科大學藥學院，廣東 東莞 53808；. 廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 53808）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一。化療是腫瘤的治療方式之一，雖然在臨床上出現了許多抗腫瘤的化療藥物，并且配合放療可以使患者的病情有所好轉，延長了壽命，但這些化療藥物常常會導致人體出現各種不良反應和毒副作用，從而使腫瘤患者在治療過程中產生其他疾病或損傷。中草藥具有使用歷史悠久，毒副作用相對較小，效果較好等優勢，因此從中草藥中開發新的防治腫瘤的天然藥物是研究方向之一。5F是嶺南草藥半邊旗中的一種二萜類成分，全稱為11β-hydroxy-15-oxo-16-ent-kaur-16-en-19-oic acid或 ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid[1]，具有抗炎、抑制多種腫瘤細胞增殖等作用[2-5]。但關于5F對結直腸癌的影響報道很少。本研究探討二萜化合物5F對結直腸癌細胞凋亡及自噬的影響，并初步探究其抗腫瘤作用的機制。

1 材料

1.1 試藥

5F（HPLC純度≥98%；廣東醫科大學天然藥物研究與開發重點實驗室自制）[4]。二甲基亞砜（DMSO）、MTT（法國MP公司）；Hoechst 33342（Beyotime公司）；z-VAD-fmk（R&D systems公司）；吖啶橙（AO）、氯喹（CQ）（美國Sigma公司）。人結直腸癌細胞SW480、HCT116（中國科學院上海細胞庫）。RPMI 1640培養液、胎牛血清（美國Gibco公司）；青-鏈霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司）；蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B抗體（美國Cell Signalling Technology公司）；β-actin（北京中杉金橋公司）；辣根過氧化物（HRP）標記山羊抗兔、HRP標記山羊抗鼠二抗（武漢Boster 公司）；ECL 化學發光試劑盒（美國Millipore公司）。

1.2 儀器

Nikon Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），Thermo Scientific Multiskan Sky全波長酶標儀（美國Thermo公司），化學發光成像儀MiniChemi Ⅱ（北京賽智創業科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

人結直腸癌細胞SW480、HCT116生長在含1% 青-鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈單層貼壁狀態生長，細胞生長狀態良好。每2日細胞傳代一次。

2.2 MTT法測定5F對結直腸癌細胞生長活力的影響

分別取對數生長期的SW480、HCT116細胞，棄上清液，PBS漂洗2次，用0.25%的胰酶消化，完全培養液中和胰酶，離心，棄上清液，將細胞密度調整成8×104個·mL-1。并以每孔100 μL接種在96孔板中，培養過夜，待細胞貼壁后，每孔加100 μL 5F溶液，使藥物的終濃度分別為0（空白組）、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1，每個處理設5個重復。培養24、48 h后每孔加5 g·L-1MTT 20 μL，反應 4 h，吸出上清液，加200 μL DMSO，振蕩溶解甲瓚結晶，用酶標儀在490 nm 處測OD值。

2.3 Hoechst 33342染色

將細胞密度為8×104個·mL-1的SW480、HCT116細胞分別接種于6孔板中，培養過夜待細胞貼壁后，加入0（空白組）、25、50、100 μmol·L-1的5F溶液，培養48 h，吸出舊培養液，PBS洗2次，加Hoechst 33342后于37℃孵育15 min，PBS漂洗2次，然后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態。

2.4 Western blot檢測相關蛋白的表達水平

5F分別處理SW480、HCT116細胞相應時間后，棄去舊液，收集細胞，加RIPA裂解液裂解，并于4℃、12 000 r·min-1離心25 min，取上清液，得總蛋白。采用BCA法檢測各組總蛋白含量。每組蛋白分別加一定量的上樣緩沖液并混合均勻，在沸水浴中變性5 min。各組取等量蛋白經SDSPAGE電泳，分離結束后，用轉膜儀轉移至PVDF膜上，然后將PVDF膜放入5% 脫脂奶粉中封閉1 h。加一抗Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B（1∶1000），4℃孵育過夜。用稀釋10 000倍的HRP酶標記的二抗，室溫孵育 60 min，吸出二抗，TBST洗滌3次，每次5 min。在避光條件下，混合化學發光液A和B，再在膜上滴加混合均勻的化學發光試劑，然后將膜置于化學發光成像儀的暗室中曝光，拍照并分析相關蛋白表達的變化。

2.5 AO染色檢測細胞內酸性細胞器

將細胞密度為8×104個·mL-1的SW480、HCT116細胞分別接種于12孔板中，培養過夜，待細胞貼壁后，加入不同濃度的5F溶液，培養24 h，吸出舊液，PBS洗1遍，4%多聚甲醛室溫固定15 min，每孔加入1 μg·mL-1的 AO工作液，室溫避光孵育15 min，去除AO工作液，PBS 洗2次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件統計分析數據，實驗數據用均值±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 二萜化合物5F對結直腸癌細胞生長的影響

圖1為MTT 法檢測不同濃度5F對SW480、HCT116細胞活力的影響。5F分別作用結直腸癌細胞24 h、48 h后，隨著藥物濃度增加，細胞存活率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。同一濃度下，隨著5F作用時間增加，細胞活力也降低。

圖1 5F對人結直腸癌SW480、HCT116細胞活力的影響Fig 1 Effect of 5F on cell viability of SW480 and HCT116 cells

3.2 倒置熒光顯微鏡觀察5F對結直腸癌細胞形態的影響

圖2為倒置熒光顯微鏡觀察5F對結直腸癌細胞SW480、HCT116形態的影響。倒置顯微鏡下，空白組細胞貼壁正常生長；不同濃度5F分別處理結直腸癌細胞48 h，隨著5F濃度增加，SW480和HCT116細胞的形態變圓，密度變小。Hoechst 33342染色，空白組細胞的細胞核呈正常均勻的藍色熒光；5F作用SW480和HCT116細胞后出現細胞核固縮現象，細胞核呈現明顯的亮藍色熒光，且隨著5F濃度的增加，呈現明顯亮藍色熒光的細胞核數目也增加。

圖2 5F對SW480、HCT116細胞形態學的影響（×200）Fig 2 Effect of 5F on morphology of SW480 and HCT116 cells（×200）

3.3 5F處理結直腸癌細胞后凋亡相關蛋白的表達

Hoechst 33342染色顯示5F處理結直腸癌細胞后表現出凋亡的特征，細胞死亡是否由凋亡引起，還需進一步證明。因此本研究用 Western blot檢測了與凋亡相關的蛋白表達，結果見圖3。不同濃度的5F分別處理SW480、HCT116細胞24 h，隨著5F 濃度的增大，Pro-Caspase-3蛋白的表達呈下調趨勢，而Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白的表達逐漸增加；與空白組比較，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。說明5F有誘導SW480、HCT116細胞凋亡的作用。

圖3 5F對SW480、HCT116細胞相關凋亡蛋白的影響Fig 3 Effect of 5F on apoptosis-related proteins in SW480 and HCT116 cells

3.4 5F誘導結直腸癌細胞凋亡與Caspase的相關性

為了進一步明確5F 誘導的凋亡是否與Caspase依賴的機制有關，本實驗使用了Caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk。分別將SW480、HCT116細胞在加或不加z-VAD-fmk（50 μmol·L-1）培養1 h后，再加或者不加5F（100 μmol·L-1）作用24 h。如圖4所示，Western blot檢測結果顯示，與5F單獨處理的結直腸癌細胞Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達明顯相比；5F和z-VAD-fmk共同作用的結直腸癌細胞Cleaved Caspase-3（P＜0.01）、Cleaved PARP（P＜0.01）蛋白表達顯著下調，表明z-VAD-fmk可阻斷caspase激活。說明5F誘導的凋亡與Caspase 依賴的機制有關。

圖4 5F聯合z-VAD-fmk處理對SW480、HCT116細胞Caspase-3及PARP蛋白的影響Fig 4 Effect of 5F combined with z-VAD-fmk on Caspase-3 and PARP proteins in SW480 and HCT116 cells

3.5 5F誘導結直腸癌細胞凋亡與Bax 和Bcl-2的相關性

如圖5所示，不同濃度的5F分別處理SW480、HCT116細胞24 h，隨著5F濃度的增大，Bax蛋白表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平下降。表明5F可通過改變Bax、Bcl-2蛋白的表達促進細胞凋亡。

圖5 5F對SW480、HCT116細胞Bax和Bcl-2蛋白的影響Fig 5 Effect of 5F on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in SW480 and HCT116

3.6 AO染色觀察5F對結直腸癌細胞酸性小泡細胞器的影響

AO染色可使細胞核和細胞質染成綠色，酸性囊泡被染成紅色[6]。圖6所示，AO染色法觀察不同濃度的5F對SW480、HCT116細胞酸性小泡細胞器的影響。結果顯示，25、50 μmol·L-1的5F分別處理結直腸癌細胞24 h后，細胞內被AO染成紅色的酸性小泡有增加趨勢；100 μmol·L-1的5F處理結直腸癌細胞24 h后，代表酸性小泡的紅色熒光反而減少。

圖6 AO染色觀察5F對結直腸癌細胞酸性小泡細胞器的影響（×200）Fig 6 Effect of 5F on acidic vesicular organelles in CRC cells by acridine orange staining（×200）

3.7 5F對結直腸癌細胞LC3蛋白表達的影響

LC3在自噬的發生中扮演著重要的角色。LC3-Ⅱ是自噬體形成的特異性蛋白標志物，LC3-Ⅱ的量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率可能與細胞內自噬囊泡的量成正相關。圖7所示，Western blot顯示，SW480、HCT116細胞經5F處理 24 h后，在0～50 μmol·L-1內，隨著5F 濃度的增加，LC3-Ⅱ的蛋白條帶逐漸變深；而100 μmol·L-1的5F處理組，LC3-Ⅱ的蛋白表達明顯減少。提示一定濃度的5F有誘導SW480、HCT116細胞自噬的作用，而100 μmol·L-1的5F處理結直腸癌細胞主要引起細胞凋亡。

圖7 5F對SW480、HCT116細胞LC3蛋白的影響Fig 7 Effect of 5F on LC3 proteins in SW480 and HCT116 cells

3.8 5F處理結直腸癌細胞自噬與凋亡的關系

為探討5F誘導的結直腸癌細胞自噬與凋亡相互關系以及對細胞存活率的影響，本實驗用50 μmol·L-1的5F聯合10 μmol·L-1的氯喹處理結直腸癌細胞，檢測其對自噬標志蛋白LC3、凋亡相關蛋白表達和細胞存活情況的影響。結果如圖8所示，與5F組相比，5F聯合氯喹處理組LC3-Ⅱ蛋白表達增加，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP表達明顯減少（P＜0.01）。說明自噬受到抑制，凋亡也下降。圖9所示，與50 μmol·L-1的5F組比，同濃度的5F聯合氯喹處理結直腸癌細胞后細胞存活率增加（P＜0.01）；與100 μmol·L-1的5F組比，同濃度的5F聯合氯喹處理結直腸癌細胞后細胞存活率幾乎不變。

圖8 5F與氯喹聯用對SW480、HCT116細胞自噬標志蛋白LC3以及凋亡相關蛋白的影響Fig 8 Effect of 5F combined with chloroquine on LC-3 and apoptosisrelated proteins in SW480 and HCT116 cells

圖9 5F聯合氯喹對SW480、HCT116細胞存活率影響（n＝5）Fig 9 Effect of 5F combined with chloroquine on cell viability of SW480 and HCT116 cells（n＝5）

4 討論

細胞凋亡是機體細胞在發育過程中或一定條件下，受內在基因調控的細胞自主有序死亡，其在生理及病理性死亡、機體的生長發育以及細胞分化等方面發揮重要作用[7]。腫瘤細胞過度增殖，凋亡通路受阻可導致腫瘤的發生和發展。很多中藥有效成分通過誘導細胞凋亡從而發揮抗腫瘤活性。本研究發現半邊旗二萜化合物5F能顯著抑制結直腸癌細胞增殖，濃度越高抑制作用越強；Hoechst 33342染色表明5F處理結直腸癌細胞出現凋亡特征。依賴胱天蛋白酶（Caspase）的信號傳導途徑是細胞凋亡的途徑之一[7-9]，z-VADfmk是應用非常廣泛的Caspase廣譜性蛋白抑制劑[10-11]。研究發現z-VAD-fmk可減弱5F誘導的結直腸癌細胞凋亡，說明5F誘導的結直腸癌細胞凋亡是Caspase依賴的凋亡。Caspase 家族中最重要的凋亡執行者Caspase-3更被稱為“死亡執行蛋白酶”，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，是死亡受體通路和線粒體通路執行細胞凋亡的關鍵執行子[12]。PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]是一種蛋白翻譯后修飾酶，在細胞修復與凋亡的調控中起重要作用，是 Caspase-3的底物之一，可被活化的 Caspase-3 切割分解而失活，從而導致細胞凋亡[13]。本課題的研究表明5F可誘導結直腸癌細胞中Pro-Caspase-3 轉化為Cleaved Caspase-3 蛋白，效應性的 Caspase可裂解下游的PARP，出現Cleaved PARP，而PARP的降解失活使染色質DNA遭到破壞，使結直腸癌細胞失去保持穩態的能力從而發生凋亡。Bcl-2家族蛋白對細胞的凋亡起調節作用，Bcl-2是抗凋亡的負調節因子之一，當細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡；Bax是促凋亡的正調節因子之一，能促進細胞凋亡；Bax/Bcl-2 比值可作為判斷細胞是否凋亡的參考[14-16]。5F可通過上調Bax，下調Bcl-2蛋白的表達促進細胞凋亡。

自噬和凋亡是細胞命運調節的兩種基本病理生理機制[17]。自噬和凋亡之間的相互作用非常復雜，然而，這些相互作用可分為三類：① 自噬與凋亡，兩者均以同步方式誘導細胞死亡，或在促進細胞死亡中起主導作用（協同作用）；② 自噬通過誘導凋亡促進細胞死亡；③ 自噬抑制凋亡誘導的細胞死亡[18]。姜黃素類似物EF24對A549細胞處理中自噬促進細胞凋亡，而EF24濃度為16 μmol·L-1時，A549細胞以凋亡為主[19]。本研究發現，AO染色表明5F處理結直腸癌細胞出現自噬特征，但100 μmol·L-1的5F誘導的細胞自噬明顯減少。與此結果一致，低濃度5F處理結直腸癌細胞時，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ表達增加，而100 μmol·L-1的5F處理的結直腸癌細胞LC3-Ⅱ蛋白表達明顯降低。5F與自噬抑制劑聯用，削弱了低濃度5F對結直腸癌細胞的抑制作用，表明5F通過自噬從而抑制結直腸癌細胞的生長。但當100 μmol·L-1的5F與自噬抑制劑聯用時，并沒改變結直腸癌細胞的存活率，表明100 μmol·L-1的5F處理結直腸癌細胞主要引起細胞凋亡。

綜上所述，5F可通過增加Bax蛋白，降低Bcl-2蛋白，影響下游成員Cleaved Caspase-3 以及Cleaved PARP等蛋白表達，從而促進結直腸癌細胞凋亡；低濃度的5F還可誘導結直腸癌細胞發生自噬，自噬對凋亡起促進作用；高濃度的5F主要誘導結直腸癌細胞凋亡。本研究為5F防治結直腸癌奠定了實驗基礎，為將來進一步利用自噬促進劑從而達到細胞死亡的目的以及選擇最優的藥物濃度防治結直腸癌提供研究方向。