克班寧對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

譚佳杰，向玉玲，熊遠果，張洪（武漢大學人民醫院藥學部，武漢 430060）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為世界上最常見的癌癥之一，常由包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、過量飲酒、非酒精性脂肪肝在內的各種風險因素導致[1-2]。其常見的治療方法包括手術切除、肝移植、局部消融和經導管動脈化療栓塞術，其中晚期肝癌患者的臨床療效和預后非常差，迫切需要更有效的治療藥物[3-4]。

克班寧（crebanine）作為一種阿樸啡類異喹啉生物堿，存在于防己科千金藤屬（Stephania Lour）植物中，多來自其中的千金藤亞屬（Subgen. Stephania）和山烏龜亞屬（Subgen. Tuberiphania）[5]。研究發現，在云南地不容中，阿樸啡型和原小檗堿型生物堿最多，其中克班寧是含量最高的阿樸啡型化合物之一[6]。迄今為止，對于克班寧的性質結構已有了一定的探索結果[7-9]，且發現它具有抗心律失常等多種藥理活性[10-13]。同時，已有多個研究證明克班寧能有效抑制白血病、纖維肉瘤、宮頸癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤細胞的活性[14-17]。Yodkeeree等[18]發現克班寧能通過下調侵襲遷移相關因子的表達來抑制肺癌的遷移和侵襲，另外Wongsirisin等[19]還發現克班寧作用于HL-60細胞后，能通過調控凋亡相關蛋白來介導細胞凋亡。

但關于克班寧對肝癌的生物學影響，目前還未見更深入的報道，因此，本研究的目的在于探索克班寧對肝癌生物學方面的影響，從而為未來開發克班寧在肝癌方向的治療作用提供一定的參考，并奠定相應的研究基礎。

1 材料

1.1 試藥

克班寧（分子式：C20H21NO4，純度≥ 98%，規格：20 mg，批號：RFS-K02811812016，成都瑞芬思生物科技有限公司，化學結構如圖1）；DMEM高糖培養基（批號：8120360）、胎牛血清（批號：20012050）（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（批號：C0038，上海碧云天生物技術有限公司）；Hoechst 33258染色試劑盒（批號：G1011）、PBS（批號：G4202）（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒（批號：8086787，美國BD公司）；FoxO3a抗體（批號：10849-1-AP）、p-AKT抗體（批號：28731-1-AP）、p-FoxO3a抗體（批號：28755-1-AP）（武漢三鷹生物技術有限公司）；BAX抗體（批號：5023S）、Bcl-2抗體（批號：3498S）、PARP抗體（批號：9532S）、AKT抗體（批號：9272S）、β-actin抗體（批號：4970S）、二抗antirabbit IgG（H+L）（批號：5151S）（美國CST公司）。

圖1 克班寧的化學結構Fig 1 Chemical structure of crebanine

1.2 儀器

HERAcell 160i二氧化碳培養箱（美國Thermo）；TC20細胞計數儀（美國BIO-RAD）；EnSight酶標儀（美國Perkin Elmer）；CytoFlex流式細胞儀（美國Beckman Coulter）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）；DYY-7C蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統（美國Li-COR）。

1.3 細胞和培養

人肝癌細胞系Huh7（中國科學院上海細胞生物研究所），采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基，在37℃、5% CO2條件下的細胞培養箱中培養，每2～3 d換液傳代。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細胞存活率

將Huh7細胞以每孔1×104個接種至96孔板中，培養24 h后，按照0（對照組）、12、36、48、60、96 μg·mL-1的分組分別給予克班寧，每個質量濃度6個復孔，然后繼續在相同條件下培養，待24、48和72 h后，在每孔中加入10 μL CCK-8工作液，在 450 nm波長下測定各孔的吸光度值。細胞存活率（%）＝（給藥組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）×100%。

2.2 細胞形態學觀察

取對數生長期的Huh7細胞，以每孔4×106個接種于6孔板中，待培養24 h后給予不同質量濃度的克班寧[0（對照組）、36、48、60 μg·mL-1]，繼續培養24 h后棄去培養基，用PBS清洗2次，加入1 mL DMEM后在倒置顯微鏡下觀察肝癌細胞的生長狀態和形態變化，并拍照記錄。

2.3 克隆形成實驗

將Huh7細胞以每孔4×103個接種到6孔板中，放入培養箱培養24 h，給予克班寧，在24 h后棄去培養基，重新加入新鮮培養基，待14 d后用PBS清洗2次，并以4%多聚甲醛固定20 min，之后用0.5%結晶紫染色，30 min后清洗并晾干，同時拍照記錄。細胞數＞30個為一個集落，克隆形成率（%）＝每組的克隆形成數/接種細胞數×100%。

2.4 Hoechst 33258實驗

細胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項下，給藥24 h后用PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛固定20 min，加入Hoechst 33258工作液避光孵育30 min，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項下，給藥24 h后，收集培養基，PBS清洗2次，用無EDTA胰酶消化，1000×g離心5 min，再次用PBS清洗2次，每組加入100 μL緩沖液、5 μL AnnexinⅤ-FITC及5 μL PI，避光孵育25 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6 Western blot實驗

將對數生長期的Huh7細胞以每孔7×106個接種于100 mm的培養皿中，培養24 h后給予克班寧，再孵育24 h后，提取蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。將蛋白上樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，2 h后恒流進行電轉，之后用5%的BSA封閉1.5 h，加TBST清洗，然后用相應一抗在4℃條件下孵育過夜；再次用TBST清洗，之后加入HRP標記的二抗（1∶10 000）孵育2 h，同樣用TBST清洗，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統掃描目的條帶。掃描結果用Image J軟件測定灰度值，最后目的蛋白的相對表達量＝目的蛋白的灰度值/內參的灰度值。

2.7 統計學處理

采用GraphPad Prism軟件進行統計分析和圖片制作，數據以x±s表示，3組及以上數據組間差異評估采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。各實驗至少重復3次。

3 結果

3.1 克班寧對肝癌Huh7細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結果見圖2，與對照組相比，隨著給藥濃度增加（0、12、36、48、60、96 μg·mL-1）Huh7細胞的增殖活性逐漸降低，且細胞的存活率隨著時間的增長（24、48、72 h）也顯著降低（P＜0.01），總體呈現出良好的劑量和時間依賴性；根據GraphPad軟件計算得出IC50值：24 h為（45.05±1.48）μg·mL-1，48 h為（24.47±0.52）μg·mL-1，72 h為（15.90±0.40）μg·mL-1。克隆形成實驗結果見圖3，給藥劑量越大，克隆形成的數量越少，密度越小，克班寧的質量濃度對肝癌細胞長期增殖能力的影響較大，具有濃度依賴性（P＜0.01）。

圖2 不同濃度克班寧作用不同時間對肝癌Huh7細胞活力的影響（n＝6）Fig 2 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells at different time（n＝6）

圖3 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞活力的影響Fig 3 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells

3.2 克班寧對肝癌Huh7細胞形態學的影響

從圖4可觀察到克班寧對Huh7肝癌細胞形態上的影響較為明顯，對照組肝癌細胞生長狀態良好，Huh7細胞緊密貼壁，且細胞形狀多保持完整，呈現不規則多邊形，多為梭形；而隨著克班寧給藥劑量的增加，細胞生長狀態不斷下降的同時密度也降低，且逐漸出現大量的空泡，當給藥劑量達到60 μg·mL-1時，大量肝癌細胞縮小變圓，無法保持基本的癌細胞形態。這表明克班寧有較好的抑制肝癌Huh7細胞的作用。

圖4 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞形態的影響Fig 4 Effect of different concentrations of crebanine on the morphology of Huh7 cells

3.3 克班寧對肝癌Huh7細胞的促凋亡作用

從圖5A可以看出，相比于對照組在熒光倒置顯微鏡下呈現出的均勻染色，細胞核形狀完整的狀態，給予了一定劑量的克班寧的肝癌細胞則逐漸皺縮，破碎，細胞核也大多形態異常，并且這種狀況隨著劑量的加大而變得更加嚴重；由流式細胞術的檢測結果可知（見圖5B），克班寧作用于Huh7細胞24 h后，細胞凋亡率隨著濃度的升高而增加，晚期凋亡細胞數量從對照組的5.13%上升至38.2%，可見克班寧對肝癌Huh7細胞的促凋亡作用有劑量依賴性。

圖5 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of different concentrations of crebanine on the apoptosis of Huh7 cells

3.4 克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡相關蛋白的表達影響

Western blot檢測凋亡相關蛋白的檢測結果如圖6A所示，與對照組相比，克班寧給藥組肝癌細胞中BAX、Cleaved-PARP 蛋白表達均顯著增加，Bcl-2 蛋白表達則顯著降低；各個凋亡蛋白的相對表達量見圖6B，克班寧的濃度越高，BAX蛋白表達水平越高，相對的Bcl-2 蛋白表達越低。為了研究克班寧對Huh7細胞凋亡和增殖的影響是否與Akt/FoxO3a信號通路有關，本研究采用Western blot檢測不同濃度克班寧處理的Huh7細胞中相關蛋白（AKT、p-AKT、FoxO3a和p-FoxO3a）的表達水平。根據圖7A結果所示，AKT和FoxO3a的表達水平幾乎保持不變，而p-AKT和p-FoxO3a的表達水平隨著克班寧濃度的增加而下降。綜合圖7B的結果來看，中、高濃度克班寧顯能著抑制AKT/FoxO3a信號通路蛋白的表達（P＜0.01）。

圖6 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡蛋白表達的影響Fig 6 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of apoptosis protein in Huh7 cells

圖7 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞不同蛋白表達的影響Fig 7 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of different proteins in Huh7 cells

4 討論

HCC有著起病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，預后差等特點；且研究發現HCC患者的平均年生存率低于10%[20]，在晚期肝癌患者全身治療藥物有限，對傳統化療藥物極為不敏感的情況下[21]，即使有類似索拉非尼、樂伐替尼、納武單抗等靶點藥物的出現，也仍有大部分患者因為價格昂貴或者不良反應的原因而無法長期使用[22]，而現在，從天然化合物中提取出有效成分，研究其抑制癌癥的功能并開發成抗腫瘤藥物，已經逐漸成為熱點[23-24]。越來越多的證據表明，天然化合物可以通過抑制HCC的增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等功能來發揮抗腫瘤作用[25]。

本研究在CCK-8法和克隆形成實驗中觀察到，克班寧在體外顯著抑制肝癌Huh7細胞系的生長，這種抑制能力長期存在；且通過顯微鏡發現肝癌細胞形態異常，隨著藥物劑量增大出現空泡化和皺縮，表明其有可能被誘導凋亡，而Hoechst 33258和流式細胞實驗結果則同時證明了克班寧有促進肝癌凋亡的能力，Western blot檢測到凋亡相關蛋白BAX和Cleaved-PARP的過表達，Bcl-2的低表達，再次證實了這一猜想。

另外，本實驗還初步探索了克班寧對PI3K/AKT信號通路的影響，過去的研究發現PI3K/AKT信號通路在多種人類癌癥中異常激活，如肝癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等[26]。研究表明激活的PI3K可以磷酸化并激活AKT，而AKT是PI3K/AKT信號通路中的關鍵調節因子，被激活的AKT調節多種效應分子促進腫瘤的發展，其中FoxO3a是AKT的重要靶點之一[27]。在PI3K/AKT信號通路被異常激活后，AKT對FoxO3a的磷酸化觸發了FoxO3a蛋白，使其從細胞核到細胞質的快速重新定位，激活或抑制FoxO3a相關信號分子；其中，受FoxO3a調控的Bim、PUMA、14-3-3、FasL和TRAIL都是與凋亡相關的蛋白[28-29]。而Hagenbuchner等[30]在研究中證明了FoxO3a不僅影響線粒體功能及相關凋亡因子的表達，還通過誘導線粒體活性氧（ROS）的積累和Bcl-2蛋白家族的表達來控制細胞凋亡的進程。另外，Yan等[31]的研究結果也表明了庫潘尼西（copanlisib）通過AKT/FoxO3a/PUMA軸對結直腸癌有細胞毒性和促凋亡作用。還有研究表明，扁蒴藤素（pristimerin）可以直接調控PI3K/AKT/FoxO3a途徑引發葡萄膜黑色素瘤的細胞死亡[32]。而在本實驗中發現克班寧可顯著抑制AKT磷酸化，同時減少FoxO3a的磷酸化，證明克班寧可以干擾AKT/FoxO3a信號的表達，從而對肝癌產生細胞毒性，致使細胞死亡。

綜上所述，克班寧對肝癌Huh7細胞增殖有明顯的抑制作用，同時促進了肝癌細胞的凋亡，能顯著促進或抑制凋亡相關蛋白的表達，而早在之前的研究中就已經證實AKT/FoxO3a是調節細胞凋亡的關鍵通路之一[33-34]；因此，初步推測克班寧的促凋亡作用可能是通過抑制AKT/FoxO3a信號通路產生的。當然，兩者之間的關系需要進一步的實驗驗證，而本課題組也只是對克班寧抗肝癌作用進行了初步研究，其對肝癌遷移、侵襲和其他功能的影響未來仍需更為深入的探討。