芹菜素納米膠束的制備工藝優化及質量評價

劉雄英，周韻秋，于恩江，典成陽，冉夢楠，典靈輝（廣東醫科大學藥學院，廣東 東莞 523808）

芹菜素（apigenin，API，4'，5，7-三羥基黃酮）是一種天然存在的黃酮類化合物，無毒，具有抗氧化、抗炎、神經保護、抗腫瘤等藥理作用[1-2]，能抑制乳腺癌、肺癌、肝癌等多種類型腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用[3-4]。然而芹菜素屬于生物藥劑學分類系統Ⅱ類藥物（即低溶解性和高滲透性），它在pH 1.0、6.8和7.5下的溶解度分別為1.43、1.56和2.16 μg·mL-1，其水溶性較差、腸道吸收少，生物利用度較低[5]，這影響了其在體內發揮活性，限制了臨床應用。

提高芹菜素的溶解度和口服生物利用度的方法有很多，比如制備成納米顆粒、脂質體、納米乳劑等，但作用效果不顯著[6]。而納米膠束作為一種新型的納米藥物遞送系統，具有載藥范圍廣、組織滲透性好等優點，且能提高難溶性藥物的溶解度和控制藥物釋放，具有更好的應用前景[7-9]。聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）是一種兩親性非離子型共聚物，其兩親性結構可在溶液中自組裝形成納米膠束，可以將難溶性藥物溶于疏水核心，提高難溶性藥物的溶解度[10-11]，具有較低的臨界膠束濃度（6.44×10-8mol·L-1），在水中易形成穩定的膠束。Soluplus的疏水結構具有羰基，能與具有羥基的化合物形成氫鍵，增強納米膠束的穩定性[12]。D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）是一種非離子表面活性劑、增溶劑、吸收促進劑，能顯著促進難溶性藥物的溶解度及其在體內的吸收[13]。TPGS常與其他材料制備混合膠束或納米粒，增強單一膠束的穩定性，并能形成功能化納米膠束，促進藥物的吸收，增強藥物治療效果[14]。

因此，本試驗以Soluplus為納米載體材料，采用薄膜分散法制備芹菜素納米膠束（apigeninloaded soluplus nanomicelles，API-PMs），用響應面法對其制備工藝進行優化，并考察其體外釋放特性，為進一步開發利用芹菜素奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

UM-4T磁力攪拌器（北京憂晟聯合科技有限公司），KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司），SZ-100納米粒度分析儀（日本HORIBA公司），UV-650型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），WQF-510A型傅里葉變換紅外光譜儀（北京瑞利分析儀器有限公司），RE52CS旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

芹菜素（批號：CAS 520-36-5，質量分數≥98%）、D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS，批號：CAS 9002-96-4）（美國Sigma公司），聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus，批號：84414368E0，德國BASF公司），Tween80（化學純，天津市富宇精細化工有限公司），甲醇、無水乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）水為超純水。

2 方法與結果

2.1 芹菜素含量測定

2.1.1 芹菜素紫外檢測波長的確定 取適量芹菜素配制芹菜素乙醇溶液，用紫外分光光度計在200～600 nm內掃描，確定芹菜素的檢測波長為336 nm，且各輔料對芹菜素的測定無干擾。

2.1.2 線性關系和方法學考察 分別配制質量濃度為 1、2、5、10、20、30、40、50 μg·mL-1的芹菜素乙醇溶液，測定吸光度（A），以芹菜素質量濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標，A為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線A＝0.0766C+0.0102，r＝0.9999，線性范圍為1～50 μg·mL-1。低、中、高濃度（5、20、50 μg·mL-1）的芹菜素乙醇溶液日內精密度的RSD分別為 1.1%、0.79%、1.6%（n＝3），日間精密度的RSD分別為1.8%、0.56%、1.5%（n＝3），平均回收率分別為105.2%、103.4%、100.8%，RSD分別為1.8%、0.40%、1.5%（n＝3），表明本方法的儀器精密度和回收率良好。

2.2 API-PMs的制備及處方工藝的優化

2.2.1 API-PMs的制備 采用薄膜分散法制備，稱取適量芹菜素和Soluplus于茄形瓶中，加適量無水乙醇完全溶解，于50℃減壓旋轉蒸發揮去有機溶劑，使其在瓶壁上形成一層均勻的含藥薄膜；再將一定量的TPGS水溶液加入茄形瓶中，渦旋，磁力攪拌一定時間，經過0.22 μm微孔濾膜，得淡黃色透明乳光的API-PMs溶液。

2.2.2 單因素試驗 其他條件不變，分別對芹菜素投藥量（1.0、1.5、2.0、2.5、3 mg）、TPGS濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1）、磁力攪拌時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、磁力攪拌速度（400、500、600、700、800 r·min-1）進行單因素試驗，采用紫外分光光度計和納米粒度分析儀測定膠束的包封率和粒徑的變化。

結果如圖1所示，芹菜素投藥量對納米膠束粒徑影響較大，隨著投藥量的增加，粒徑逐漸增大，而包封率緩慢減小；當投藥量在1.5 mg時具有最大包封率。隨著TPGS濃度的增加，粒徑無明顯變化，包封率則緩慢增大；當TPGS濃度為0.4 mg·mL-1時，包封率最大。隨著磁力攪拌時間的增加，粒徑無明顯變化，包封率在攪拌時間為3 h時最大。隨著磁力攪拌速度的增大，粒徑無明顯變化，當磁力攪拌速度為700 r·min-1時，包封率最大。

圖1 單因素對納米膠束包封率和粒徑的影響Fig 1 Effect of single factor on the encapsulation efficiency and particle size of API-PMs

2.2.3 Box-Behnken設計（BBD）-響應面試驗優化納米膠束的制備工藝

① BBD 試驗設計與結果：根據單因素試驗結果，采用BBD響應面法來進行制備工藝優化，以投藥量（A）、TPGS濃度（B）、磁力攪拌速度（C）和磁力攪拌時間（D）為因素，并以包封率、載藥量和粒徑為響應值進行試驗，試驗數據運用軟件Design-Expert 8.0.6分析處理，因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factor and level

由于試驗設計包括包封率、載藥量和粒徑三個指標評價，因此可采用多指標數據總評歸一值（overall desirability，OD）法，對取值越小越好的指標（粒徑）和取值越大越好的指標（包封率和載藥量），采用Hassan 方法，通過計算各個實驗指標“歸一值”的幾何平均值，得到綜合評價的“歸一值”[15]。故以OD為響應變量（Y），結果見表2。

表2 BBD響應面實驗設計與結果Tab 2 BBD response surface experiment design and results

② 模型擬合及方差分析： 以OD值為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件分別對各因素多元線性回歸和二項式擬合，得到OD值對A、B、C、D四個因素的二項式回歸方程：

OD＝0.92-0.31A+0.035B-1.944×10-3C+0.018D+0.11AB-0.016AC+0.022AD+7.34110-3BC+0.018BD-1.657×10-3CD-0.5A2+0.063B2-0.019C2-8.526×10-3D2

響應面模型對OD值的方差分析結果如表3所示，模型P值小于0.0001，表明該模型是顯著的；失擬項P值大于0.05，不顯著，說明模型方程擬合程度好，可以用此模型對制備工藝進行分析和預測；并且模型中參數A、AB、A2和B2都是顯著的，對比所有因素的F值大小，得出影響制備工藝的因素強弱排序為投藥量＞TPGS濃度＞磁力攪拌時間＞磁力攪拌速度。

表3 響應面模型對OD值的方差分析結果Tab 3 Variance analysis of response surface model on OD value

③ 響應面交互作用結果分析與預測：為了進一步研究不同因素之間交互作用以及確定最優工藝處方參數，通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制出OD值隨著不同因素交互作用變化的三維響應面圖。結果見圖2，可知，OD存在最大值，經軟件分析篩選，得到最優工藝處方參數為投藥量1.89 mg，TPGS濃度為0.49 mg·mL-1，磁力攪拌速度為662.97 r·min-1，磁力攪拌時間為2.26 h，預測粒徑為57.1 nm，包封率為99.35%，OD為1.04。

圖2 四個因素相互作用的三維響應面圖Fig 2 Three-dimensional response surface of interaction of 4 factors

④ 最優制備工藝處方的驗證：綜合實際情況，確定芹菜素投藥量2 mg，TPGS質量濃度為0.5 mg·mL-1，磁力攪拌速度為700 r·min-1，磁力攪拌時間為2.5 h，平行3次試驗，測定包封率、載藥量和粒徑。結果見表4，實際測得OD值與預測OD值基本接近，RSD為1.0%，表明該方法預測的最優工藝處方參數可靠，可用于該制備處方工藝優化。

表4 制備工藝驗證結果Tab 4 Verification of preparation process

2.3 API-PMs的質量評價

2.3.1 包封率和載藥量測定 精密吸取50 μL納米膠束溶液，加無水乙醇破乳并稀釋至5 mL，按“2.1”項下方法測定藥物的含量，平行測定3次。計算包封率和載藥量：包封率（%）＝（包封的藥物質量/加入的藥物質量）×100%，載藥量（%）＝（包封的藥物質量/膠束和藥物總質量）×100%。計算得出膠束中芹菜素的包封率和載藥量分別為（93.49±1.28）%和（4.45±0.06）%。

2.3.2 粒徑測定 取API-PMs溶液適量，加水稀釋后用納米粒度分析儀測量粒徑大小，平行測定3組，結果如圖3所示，測得的API-PMs粒徑為（62.8±1.1）nm，表明制備的納米膠束粒徑小且分布均勻。

圖3 API-PMs的粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of API-PMs

2.3.3 穩定性試驗 將API-PMs溶液置于室溫，分別在第0、7、14、21、28日測定膠束的包封率和粒徑，結果包封率和粒徑RSD分別為1.5%和1.8%，表明納米膠束在室溫條件下28 d內是比較穩定的。

2.3.4 傅里葉變換紅外光譜法（FTIR） 將芹菜素原料藥（API）、空白納米膠束凍干樣品（PMs）、芹菜素原料藥與空白納米膠束的物理混合物凍干樣品、芹菜素納米膠束（API-PMs）凍干樣品，分別與一定量的溴化鉀混合均勻，壓片，測定400～4000 cm-1內樣品的紅外光譜圖，如圖4所示，芹菜素原料藥的O-H特征吸收峰（3278 cm-1）和C＝O特征吸收峰（1654 cm-1，1608 cm-1），芹菜素原料藥與空白納米膠束的物理混合物的紅外光譜中，既有空白納米膠束的特征吸收峰，也有芹菜素原料藥的特征吸收峰；芹菜素納米膠束出現的C＝O特征吸收峰（1735 cm-1，1631 cm-1）相比空白納米膠束出現C＝O的特征吸收峰（1737 cm-1，1639 cm-1），位移發生了改變，這表明在芹菜素納米膠束中，芹菜素分子中的羥基與納米膠束疏水結構中的羰基之間形成了氫鍵。

圖4 納米膠束的紅外光譜圖Fig 4 Infrared spectra of nanomicelles

2.3.5 體外釋放試驗 在參考文獻[16]和預試驗的基礎上，采用動態透析袋法考察API-PMs中芹菜素的釋放行為。分別取1 mL API溶液和1 mL API-PMs溶液，置透析袋（截留分子量為10000 Da），兩端扎緊，在滿足漏槽條件的前提下，放入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.5% Tween 80）20 mL釋放介質中。在37℃、100 r·min-1條件下振搖，分別于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48、72 h時取出全部釋放介質（同時補入同溫等量的新鮮釋放介質），平行3組。按“2.1”項下方法測定釋放介質中芹菜素的含量，計算累積釋放率（Q），繪制釋放曲線。結果如圖5所示，API在72 h內僅釋放出30.04%，API-PMs在72 h內持續緩慢釋放出43.63%，具有明顯的緩釋作用。采用Higuchi方程對膠束的體外釋放數據進行擬合，顯示其體外釋放符合Higuchi方程，所得回歸方程Q＝5.326t1/2，r＝0.9991，表明其體外釋放以擴散為主，藥物從膠束的疏水內核中慢慢擴散到釋放介質中。

圖5 API和API-PMs的累積釋放曲線（n＝3）Fig 5 Cumulative release profile of API and API-PMs（n＝3）

3 討論

本試驗通過單因素試驗和Box-Behnken設計-響應面法，優化API-PMs的制備工藝，驗證試驗顯示實測值與預測值偏差較小，表明Box-Behnken設計-響應面法具有較好的預測性，可用于API-PMs的制備工藝的優化設計。

對于納米膠束輸送系統，更高的包封率和載藥量意味著同等給藥劑量下進入患者體內的載體材料和輔料更少，毒性和免疫原性風險更低。本試驗中的API-PMs具有較高的包封率和載藥量，表明藥物包封與載體載藥性能良好。其粒徑約62 nm，小于100 nm，符合口服吸收的粒徑范圍[17]。穩定性試驗結果顯示，API-PMs在常溫條件下貯存28 d后，其包封率和粒徑沒有顯著變化，表明納米膠束性質穩定，藥物不易析出且貯存方便。從FTIR分析可以得出，芹菜素與載體之間形成的氫鍵提高了納米膠束的穩定性，使得載藥量和包封率增加，減少藥物泄漏[18]。

體外釋放試驗中，在滿足漏槽條件的前提下，選擇磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.5% Tween 80）為其釋放介質，結果顯示，芹菜素原料藥水溶性差，快速在透析袋中沉淀，不再釋放，而API-PMs具有明顯的緩慢擴散作用，達到了緩釋、長循環的目的。本試驗制備的API-PMs中加入TPGS吸收促進劑，有利于胃腸道對納米膠束的吸收，而納米膠束能否促進芹菜素吸收，有待進一步研究。