基于網絡藥理學和UPLC-Q-TOF/MS結合動物實驗探究蓍草預防急性肝損傷的作用機制

王超，付瑞嘉，左倩，徐頂巧，樂世俊，唐于平（陜西中醫藥大學 陜西省中醫藥管理局中藥配伍重點研究室，西安 712046）

急性肝臟損傷（acute liver injury，ALI）可由多種因素誘發，包括酒精、藥物濫用、病毒感染、代謝和自身免疫攻擊[1-2]。ALI發展末期會演變成肝纖維化或肝硬化，治療難度高，治療費用昂貴，故對肝臟疾病的早期防治十分重要。研究表明，肝損傷的病理過程中伴隨著大量的炎癥和氧化應激反應，抑制炎癥以及緩解氧化應激反應對于治療肝損傷具有重要意義[3]。因此，具有抗炎和抗氧化活性的藥物可用于治療肝損傷。蓍草來源于菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分，具有解毒利濕、活血化瘀的功效[4]。現代研究表明，蓍草具有抗炎[5]、抗氧化、抗菌[6]的作用，能夠顯著改善高血壓[7]、肝損傷[8]等疾病。蓍草治療肝損傷的藥效確切[9-10]，但是缺乏藥效物質基礎和作用機制的研究。網絡藥理學是基于系統生物學和藥理學的綜合性學科，通過分析生物網絡和生物功能，從而系統化闡明藥物分子作用機制。故本研究基于UPLC-Q-TOF/MS分析鑒定蓍草中含有的成分，然后利用網絡藥理學篩選預測這些成分作用的靶點并結合動物實驗對網絡藥理學分析結果進行驗證，進而初步探究蓍草防治ALI的藥效及作用機制，以期為臨床治療ALI提供指導。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠24只，體質量（200±20）g [成都達碩實驗動物有限公司，合格證號SCXK（川）2020-030]，動物實驗經陜西中醫藥大學倫理委員會批準，動物飼養和實驗操作均符合實驗管理條例要求。

1.2 試藥

蓍草購自銅陵禾田中藥飲片股份有限公司，藥材經陜西中醫藥大學顏永剛教授鑒定為菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分；聯苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團有限公司，規格：1.5 mg，批號：19J210318）。四氯化碳（CCl4，天津市天力化學試劑有限公司，批號：20210902），橄欖油（上海源葉生物科技有限公司，批號：H29O11P129145），LC-MS級甲醇（Honeywell Burdick & Jackson 公司），LC-MS級甲酸（德國Darmstadt 默克公司），分析純甲醇（天津天利化學試劑有限公司），二甲苯、正丁醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），檸檬酸抗原修復液、環保型脫蠟透明液、PBS緩沖液（武漢賽維爾科技有限公司）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、IL-1β酶聯免疫試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；一抗TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1以及二抗辣根 HRP 標記山羊抗兔IgG 抗體（武漢賽維爾科技有限公司）。

1.3 儀器

Waters ACQUITY Ⅰ-Class UPLC、Waters SYNAPT G2-Si Q-TOF 高分辨率飛行時間質譜儀（美國Waters公司），Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司），RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），多功能酶標儀（美國基因生物科技有限公司），Centrifuge 5418R臺式離心機、恒溫板式混勻儀（德國Eppendorf公司），Donatello脫水機（米蘭DIAPATH公司），JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司），RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），DHG-9140A烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF/MS 檢測蓍草的成分

2.1.1 樣品制備 取蓍草藥材（過2號篩）約2 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇40 mL，密塞，稱重，40℃水浴，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再次稱重，用70%甲醇補足損失量，搖勻，抽濾，取續濾液，即得蓍草提取液。取蓍草提取液以適量甲醇稀釋，5000 r·min-1離心5 min，取上清過0.22 μm微孔濾膜得供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 Waters Acquity BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫35℃；流動相為0.1%甲酸水（A）-純甲醇（B），梯度洗脫：0～1 min，90%A；1～5 min，90%→65%A；5～7 min，65%→60%A；7～10 min，60%→30%A；10～11 min，30%→15%A；11～11.5 min，15%→5%A；11.5～12 min，5%A。流速0.3 mL·min-1，檢測波長290 nm，進樣量5 μL。

2.1.3 質譜條件 ESI源條件：負離子模式，毛細管電壓2.5 kV，樣品錐孔溫度55℃，源溫度120℃，脫溶劑氣溫度280℃，錐孔氣體流量50 L·h-1，氮氣作為霧化氣（600 L·h-1），掃描模式為全掃描，掃描范圍m/z100～1200 Da。采用MassLynx v4.2軟件處理數據。

2.2 網絡藥理學

2.2.1 關鍵靶點的篩選 將UPLC-Q-TOF/MS檢測到的成分英文名輸入TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）獲取作用靶點。對于靶點較少或檢索不到作用靶點的成分，使用PubChem數據庫查詢獲取成分的Canonical SMILES 號，將SMILES號上傳至Similarity Ensemble Approach數據庫（http：//sea.bkslab.org/）和Swiss Target Prediction平臺（http：//www.swisstargetprediction.ch/），預測這些成分可能作用的靶標點。以“acute liver injury”或“acute hepatic damage”為關鍵詞，在OMIM（https：//www.omim.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中檢索，合并并去掉重復靶點，得到ALI疾病相關作用靶點。最后，使用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）將所有靶點名稱標準化。將蓍草成分的作用靶點與疾病靶點取交集并將交集靶點導入Venn平臺繪圖，獲得蓍草防治ALI的關鍵靶點。將蓍草成分與關鍵靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件構建蓍草“成分-靶點-疾病”網絡關系圖并分析。

2.2.2 靶點蛋白互作（PPI）網絡分析 將交集靶點導入STRING （https：//string-db.org/）數據庫，構建PPI網絡，限定物種為“Homo sapiens”，蛋白互作評分設定為最低不小于0.4，刪除與其他蛋白無相互作用的蛋白，將結果保存為“TSV”格式文件并導入Cytoscape 3.8.2軟件進行網絡拓撲分析，以各個節點的連接度（Degree），介度（Betweenness）及緊密度（Closeness）均大于其中位數為篩選條件篩選核心靶點。

2.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析 將交集靶點輸入DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫中，設置物種為“Homo sapiens”，進行GO功能富集分析及KEGG通路分析。

2.3 動物實驗

2.3.1 蓍草提取液的制備 蓍草經打粉機粉碎后過2號篩，稱取150 g蓍草粉末置于2 L圓底燒瓶中，加入6倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超聲提取45 min，抽濾，藥渣置于1 L圓底燒瓶中，加入3倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超聲提取45 min，合并2次濾液，使用旋轉蒸發儀回收乙醇，濃縮藥液。本次實驗共提取蓍草600 g，按上述提取方法，分4次提取，最終合并4次濃縮藥液，超純水定容至400 mL，制備得到1.5 g·mL-1的蓍草提取液。

2.3.2 陽性藥配制方法 取聯苯雙酯滴丸10粒于研缽中碾碎成粉末，于40 mL純水中超聲溶解，得0.375 mg·mL-1的陽性藥溶液。

2.3.3 動物分組及給藥 24只大鼠適應性飼養一周后，按照正常組、模型組、蓍草組、陽性藥組隨機分為4組，每組6只，適應性飼養一周后，開始給藥。蓍草組按蓍草生藥量15 g·kg-1的劑量灌胃給藥，一日一次，連續兩周。陽性藥組使用3.75 mg·kg-1聯苯雙酯滴丸溶液灌胃給藥，一日一次，連續兩周。正常組和模型組給予純水同體積灌胃。末次給藥4 h后，除正常組外，其余各組均腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液2 mL·kg-1，正常組腹腔注射同體積橄欖油溶液，大鼠禁食不禁水12 h，烏拉坦麻醉后，腹主動脈采血，摘取肝臟。

2.3.4 臟器指數及生化指標的測定 取肝臟用冷生理鹽水沖洗干凈，用濾紙擦干，稱重并計算肝指數。肝指數（%）＝（肝重/體重）×100%。血液靜置0.5 h后，以3000 r·min-1離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書，檢測分組大鼠血清中ALT和AST水平。精密稱取肝臟組織，加入適量生理鹽水，4℃研磨成10%肝勻漿，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液檢測MDA、CAT和SOD活性水平；按照ELISA試劑盒操作檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

2.3.5 肝臟組織病理學形態變化 剪取各組大鼠肝臟同一部位組織于10%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片，進行HE染色后200倍物鏡下觀察病理狀態。

2.3.6 肝臟中TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1蛋白表達的檢測 肝臟組織切片，常規脫蠟至水，使用檸檬酸緩沖液進行抗原修復，雙氧水滅活，BSA室溫封閉；加一抗[TLR-4 （1∶400）、NF-κBp65 （1∶600）、Nfr2 （1∶600）、keap1（1∶800）、HO-1 （1∶800）]4℃過夜；PBS沖洗，二抗孵育，DAB顯色后蘇木素復染，自來水沖洗，蘇木素返藍，流水沖洗，脫水封片后鏡檢，陽性為棕黃色。

2.3.7 統計學分析 數據均以±s表示，采用GraPhpad Prime 8進行統計學分析。各組間的比較均采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 蓍草UPLC-Q-TOF-MS檢測結果

運用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 得到的蓍草鑒定圖譜，見圖 1。使用 UNIFI 數據處理系統、Masslynx v4.2 軟件和查閱文獻比對，共鑒定出 20種化合物，見表 1。

表1 蓍草UPLC-Q-TOF/MS鑒定成分Tab 1 Components identified by UPLC-Q-TOF/MS of Achillea alpina L.

圖1 蓍草提取液負離子BPI模式圖Fig 1 BPI pattern of negative ions of Achillea alpina L. extract

3.2 網絡藥理學結果

3.2.1 蓍草防治ALI的“成分-靶點-疾病”網絡

通過數據庫檢索得到20個成分作用的潛在靶點共316個。從OMIM、GeneCards和NCBI數據庫中共檢索到ALI相關靶點共19 033個。將蓍草成分的作用靶點與疾病靶點取交集共得到291個關鍵靶點。將蓍草的成分和關鍵靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件構建蓍草“成分-靶點”網絡關系圖并進行拓撲分析，見圖2。根據度值進行篩選，排名前十的成分分別為異櫟素、蓍素、綠原酸、芒柄花素、雙酚A、百蕊草素Ⅱ、3，4，5-tetracaffeoylquinic acid、kaempferol 3-O-（6''-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、quercetin 3-O-（6''-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、艾黃素，這些成分可能是蓍草預防治療ALI的活性成分。

圖2 “成分-靶點”網絡圖Fig 2 “Component-target” network diagram

3.2.2 核心靶點PPI網絡 共得到104個核心靶點，見圖3。可以認為是蓍草防治ALI的核心靶點，其中節點越大，顏色越深，表明度值越大。

圖3 核心靶點PPI網絡圖Fig 3 Core target PPI network diagram

3.2.3 生物信息學分析 選取P＜0.05，GO功能排名前十，KEGG通路排名前二十的結果進行可視化，見圖4。GO生物富集結果中，生物過程（biological process，BP）主要涉及炎癥反應、凋亡及缺氧反應等；細胞組分 （cellular component，CC）主要涉及質膜、漿膜及細胞外區等；分子功能 （molecular function，MF）主要涉及氧化還原酶活性以及蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析顯示，主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路及Toll樣受體信號通路等。綜上Toll樣信號通路與ALI關系緊密，故選擇通過動物實驗對該通路進行驗證。

圖4 生物信息富集圖Fig 4 Bioinformation enrichment map

3.3 動物實驗研究

3.3.1 蓍草提取液對ALI大鼠的肝指數的影響 與正常組（N組）對比，模型組（M組）肝指數增大，血清ALT、AST水平顯著上升。與模型組相比，陽性藥組（P組）肝指數顯著降低，血清中ALT、AST水平顯著下降；蓍草給藥組（S組）肝指數顯著降低，血清中ALT、AST水平顯著下降，結果見圖5。

圖5 蓍草提取液對四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠肝指數及肝功能影響（ ±s，n＝6）Fig 5 Effect of Achillea alpina L. extract on liver index and liver function in rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（x± s，n＝6）

3.3.2 蓍草對大鼠肝臟氧化應激指標的影響 與正常組比較，模型組MDA含量增加，SOD和CAT活力明顯降低。與模型組比較，陽性藥組MDA含量顯著降低，SOD和CAT活力明顯增加；蓍草給藥組MDA含量顯著降低，SOD和CAT活力明顯增加，結果見圖6。

圖6 蓍草提取液對四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠抗氧化能力的影響（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Achillea alpina L. extract on the antioxidant capacity of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）

3.3.3 蓍草對大鼠血清炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高。與模型組比較，陽性藥組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低；蓍草給藥組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低，結果見圖7。

圖7 蓍草提取液對四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠抗炎能力的影響（ ±s，n＝6）Fig 7 Effect of Achillea alpina L. extract on anti-inflammatory ability of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）

3.3.4 蓍草對大鼠肝組織形態的影響 正常大鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑有光澤，質地柔軟；四氯化碳誘導損傷的大鼠肝臟顏色暗紅，大葉與小葉間有白色粘連，光澤度下降，被膜下游黃白色顆粒；聯苯雙酯組與蓍草給藥組的病理變化相對較輕。

正常大鼠肝臟組織結構正常，肝細胞呈索狀排列，各肝細胞間界限清晰。四氯化碳誘導損傷的大鼠肝臟細胞水腫嚴重，細胞排列紊亂，界限模糊，存在較多壞死細胞，炎癥浸潤明顯。聯苯雙酯組和蓍草給藥組大鼠肝細胞損傷程度較輕，存在有少量肝細胞水腫、壞死及炎癥浸潤。結果見圖8。

圖8 蓍草對急性肝損傷大鼠肝臟組織病理變化的影響Fig 8 Effect of Achillea alpina L. on histopathological changes in the liver of rats with acute liver injury

3.3.5 相關蛋白免疫組化染色結果 蓍草對四氯化碳誘導的ALI大鼠肝組織相關蛋白的影響如圖9所示，各蛋白在細胞質中陽性表達，棕黃色的深淺代表蛋白表達量的多少。結果表明，TLR-4、NF-κBp65、HO-1和keap1在正常大鼠肝組織中僅少量表達，模型組中四者表達量上升。相較于模型組，在使用蓍草和聯苯雙酯給藥后，TLR-4、NF-κBp65 和keap1表達量降低，HO-1在蓍草組中表達量降低，在陽性藥組表達上升。Nfr2在正常大鼠肝組織中表達量較高，在模型組中表達降低，經蓍草和聯苯雙酯給藥后的大鼠肝組織中Nfr2表達上升。

圖9 各蛋白免疫組化結果（×200）Fig 9 Immunohistochemical results for each protein （×200）

4 討論

ALI是指由多種原因引起的肝臟損傷的疾病總稱，具有發病急、易復發、風險大等特點。肝臟作為體內最大的代謝器官，藥物的代謝多在肝臟中完成，而目前臨床保肝藥物需要長時間服藥且伴有許多不良反應，這無疑加大了肝損傷的風險[11]。故尋找安全有效的治療方法是當前肝損傷臨床研究的重點問題。目前，中醫藥防治肝損傷被認為是較好的方法，但中醫藥防治肝損傷的作用機制研究尚不明朗。

本研究通過 UPLC-Q-TOF/MS檢測蓍草中的主要化學成分，共鑒定出 20 種成分。通過網絡數據庫篩選，最終選出104個核心靶點，包括 TNF、IL-6、ALB、TLR4、NFKBIA等。然后，進一步構建“成分-靶點-疾病”網絡，根據度值篩選出異櫟素、蓍素和綠原酸等10個成分。有研究表明異櫟素具有保肝退黃的作用[12]，能夠激活p38蛋白，促進Nrf2的上調，TLR、NF-κB和HO-1的下調，從而減少炎癥反應，增強抗氧化效果[13]。綠原酸具有良好的抗炎和抗氧化活性[14]，研究表明其可以通過調節Toll樣受體信號通路緩解ALI[15]。TNF、IL-6和ALB等均為體內炎癥信號傳導因子，在體內炎癥反應中大量存在，研究表明三者均參與ALI的發病過程[16]。由此表明蓍草可能通過異櫟素、綠原酸等活性成分通過作用于TNF、TLR4等核心靶點發揮預防治療ALI的作用。

GO功能富集分析表明，蓍草中活性成分可能通過質體膜、細胞膜和細胞質等細胞組分參與炎癥反應的正向調節、對缺氧的反應和凋亡過程的負調控等生物學過程，發揮酶結合、血紅素結合和蛋白磷酸酶結合等分子功能達到治療ALI的目的。KEGG 富集分析發現，蓍草治療ALI的 104 個核心靶點主要參與 Toll樣受體、IL-17、TNF 等信號通路。有文獻報道，肝損傷中肝細胞死亡受體和識別受體受到刺激，Toll樣受體會被識別激活，誘導NLRP3炎癥小體生成，從而導致肝細胞焦亡，可見Toll樣信號通路與ALI關系緊密[17]，故本研究選擇對該通路進行驗證。

使用四氯化碳誘導ALI是一種經典的ALI模型，常被用于篩選治療肝損傷的藥物中[18]。在本研究中，模型組大鼠AST、ALT以及肝指數水平顯著上升，肝細胞水腫嚴重，且存在肝細胞壞死，表明ALI模型造模成功。在給予蓍草提取液的大鼠中，ALT、AST以及肝指數水平顯著降低，肝細胞損傷程度有所緩解，表明蓍草對ALI大鼠的肝臟具有一定的保護作用。

研究表明，肝損傷的病理過程中伴隨著嚴重的氧化應激和炎癥反應[19]。四氯化碳引起肝細胞損傷后，肝臟內會產生脂質過氧化反應，產生大量過氧化物損傷肝細胞，如MDA[20]。為了防御這些物質帶來的損傷，肝臟內會產生SOD和CAT發揮抗氧化作用[21]。本研究發現，相較于模型組，蓍草給藥組可以降低肝臟組織中MDA的含量和血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提高SOD和CAT的活性。結果表明蓍草可以通過降低肝臟的氧化應激和炎癥反應保護ALI大鼠的肝臟。研究表明，細胞可以通過轉錄因子上調特定抗氧化劑以及抗氧化酶的合成，而主要被調節的轉錄因子為Nrf2[22-23]。keap1/Nrf2軸是細胞內氧化還原平衡的主要調節因子，而keap1/Nrf2/HO-1信號通路是體內維持細胞氧化還原穩態，調節炎癥和解除細胞毒性的重要途徑。當體內產生氧化應激反應時，Nrf2會從keap1中解離，轉入細胞核，并與轉錄因子結合產生復合物，復合物會與抗氧化反應元件結合，促進HO-1抗氧化基因的轉錄[24-25]。Toll樣受體信號通路與炎癥因子的調控和釋放密切相關，其激活后會合成大量TNF家族的炎癥因子。研究表明，TLR4屬于Toll樣信號通路上游信號分子，在肝細胞中廣泛存在，通過與各種病原微生物分子結合后激活，傳遞信號促使下游信號分子MyD88磷酸化，MyD88磷酸化激活后可以激活下游NF-κB分子的磷酸化，從而控制促炎因子和一些免疫相關基因的表達[26]。故本研究選擇采用免疫組化檢測Nrf2、keap1、HO-1、TLR4和NFKBIA蛋白的表達，驗證keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號通路，探究蓍草預防治療ALI的作用機制。研究結果顯示，蓍草可以提高Nrf2蛋白的表達，降低keap1、HO-1、TLR4和NFκBp65蛋白的表達，表明蓍草預保護治療ALI的機制可能與調控keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號通路有關。

綜上所述，本研究通過 UPLC-Q-TOF/MS 聯合網絡藥理學的方法，闡明了蓍草中的活性成分、靶點、通路之間的相互作用關系，并通過動物實驗對網絡藥理學的分析結果進一步驗證，發現蓍草治療ALI的作用與調節keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號通路密切相關，這可為后續臨床中治療ALI提供指導。