沙蟾毒精通過Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑誘導人胃癌SGC-7901細胞鐵死亡

王文君，劉霞霞，陳馨，程卉*，王國凱*（. 安徽中醫藥大學藥學院，合肥 23002；2. 新安醫學教育部重點實驗室，合肥 230038；3. 安徽中醫藥大學科研技術中心，合肥 230038）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，在消化道惡性腫瘤中排第二位，2020年新增100多萬病例，有76.9萬人死亡，發病率、病死率均較高[1]。多數患者確診時已經處于GC中晚期，術后易復發轉移[2]，化療有助于延長患者的生存時間，提高患者的生活質量。然而，目前的化療藥物對GC的治療效果十分有限[3-4]，因此亟待發掘新的化療藥物。

天然化合物沙蟾毒精（ArBu）是從中華大蟾蜍的蟾酥和蟾皮提取得到的一種新的潛在抗腫瘤成分[5]，分子式為C24H32O6，分子量為416.5，目前已有諸多研究發現ArBu具有廣譜抗腫瘤活性，主要通過誘導細胞凋亡、抑制血管生成以及腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲發揮作用[6-8]。

鐵死亡（ferroptosis）是一種依賴于鐵代謝的新的程序性細胞死亡方式，即在二價鐵或脂氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸，使活性氧（reactive oxygen species，ROS）積聚導致脂質過氧化，從而誘導細胞死亡[9-11]。越來越多的天然化合物被發現能通過鐵死亡途徑發揮抗腫瘤作用[12]，但未見研究報道ArBu誘導GC細胞鐵死亡。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是控制細胞氧化還原、動態平衡和炎癥的關鍵轉錄因子，與鐵死亡氧化應激通路密切相關，Nrf2可以通過調控血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）誘導鐵死亡[13-14]。因此，本研究旨在觀察ArBu是否能誘導人胃癌細胞系SGC-7901細胞發生鐵死亡，并探討其機制。

1 材料

1.1 腫瘤細胞

人胃癌細胞SGC-7901（中國科學院上海細胞庫），在含10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素混合液的RPMI-1640培養基中于37℃，5%CO2的條件下培養。

1.2 儀器

酶標儀（美國MD公司，iD3）；細胞培養箱（美國Thermo Fisher公司，BB150）；生物安全柜（浙江蘇凈凈化公司，BSC-1000ⅡA2）；離心機（德國Eppendorf公司，5418R）；顯微鏡（德國徠卡公司，DMI6000B）；透射電鏡（日本日立公司，Hitachi-600）；蛋白電泳及轉印系統（美國伯樂公司，Mini-PROTEAN）；流式細胞儀（美國Beckman公司，FC500）；凝膠成像儀（廣州博鷺騰生物科技有限公司，GelView6000Plus）。

1.3 試藥

ArBu[安徽華潤金蟾藥業股份有限公司提供，純度為94.1%，CAS：464-74-4，用二甲基亞砜（DMSO）（終濃度＜0.1%）助溶后加入 RPMI-1640培養液配制]；Fer-1（批號：#28329，規格：10 mmol·L-1×1 mL，MedChemExpress公司），CCK-8試劑盒（批號：2J226，麥客生物有限公司），谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號：20220513）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號：20211124）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20210923）（南京建成科技有限公司），脂質ROS檢測試劑盒（批號：2011556，Thermo Fisher Scientific公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：092721220221，碧云天生物技術有限公司），細胞Fe含量檢測試劑盒（批號：BC5310，北京索萊寶公司），Nrf2抗體、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（Cell Signaling Technology公司），SLC7A11抗體、鐵蛋白重鏈1（FTH1）抗體（Affinity Biosciences公司），HO-1抗體、β-actin抗體、二抗（正能生物技術有限責任公司），ECL顯影發光液（批號：22182599，蘭杰柯科技有限公司）。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖

將SGC-7901細胞接種到96孔板中培養過夜，每孔100 μL（5×103個），每組6個復孔，第2日將原培養基吸出，加入不同濃度的藥物培養基（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1ArBu，5 μmol·L-1Fer-1，0.4 μmol·L-1ArBu+5 μmol·L-1Fer-1）的培養基100 μL繼續培養24 h和48 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續在培養箱里避光培養2 h。用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度值A，用不含細胞的培養基來校正。將細胞存活率輸入GraphPad 6.0 Prism 8.0.2計算IC50。細胞存活率（%）＝[（A藥物-A空白）/（A對照-A空白）]×100%。

2.2 顯微鏡和透射電鏡觀察細胞及線粒體形態變化

將細胞分為對照組（含同濃度DMSO）、ArBu中濃度組（0.4 μmol·L-1）和ArBu聯合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）。細胞處理24 h后，分別用顯微鏡（×200）和透射電鏡（×7000）觀察細胞及線粒體形態變化。

2.3 GSH、SOD、MDA和總Fe水平的測量

將細胞分為對照組（含同濃度DMSO），ArBu低、中、高濃度組（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1）和ArBu（0.4 μmol·L-1）聯合Fer-1（5 μmol·L-1）組。細胞處理24 h后，將SGC-7901細胞用胰酶消化收集于PBS中，并于4℃條件下超聲破碎成細胞勻漿，按照試劑盒說明書操作，檢測GSH、SOD、MDA和總Fe水平。用BCA法對細胞的蛋白水平進行定量。

2.4 脂質ROS水平的測量

細胞分組同“2.3”項下。細胞處理24 h后，棄去含藥培養基，加入含有C11-BODIPY581/591熒光探針的培養基，37℃避光孵育30 min，棄去培養基，用無血清培養基洗滌3次，收集細胞后用流式細胞儀檢測熒光強度。

2.5 Western blot檢測蛋白表達

將細胞分為對照組（含同濃度DMSO）、ArBu低、中、高濃度組（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1），細胞處理24 h后收集細胞，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，加入 5×loading buffer，100℃金屬浴煮沸10 min使蛋白變性。采用SDS凝膠電泳將蛋白質分離，上樣10 μL蛋白樣品，電泳轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，孵育相對應的一抗（1∶1000），4℃過夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。ECL顯影發光液顯色，凝膠成像儀拍照，Image J 6.0軟件分析條帶灰度值，計算相對表達量（%）＝（目標蛋白÷參比蛋白β-actin的灰度值）×100%。

2.6 統計學處理

定量研究結果采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行分析并作圖。所有實驗都至少重復了3次。數據比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA）和Dunnett’s檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ArBu抑制SGC-7901細胞增殖

ArBu處理SGC-7901細胞24 h和48 h的細胞存活率結果見圖1。與對照組相比，SGC-7901細胞的存活率隨著ArBu的濃度增大和處理時間的延長逐漸降低，24 h和48 h 的IC50值分別為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1。因此，選擇0.2、0.4、0.8 μmol·L-1作為ArBu低、中、高濃度進行后續實驗。此外，與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比，ArBu聯合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）細胞存活率明顯升高（P＜0.01），說明ArBu抑制SGC-7901細胞增殖確實有鐵死亡參與，且Fer-1能部分逆轉鐵死亡所導致的細胞增殖的抑制。

圖1 ArBu對SGC-7901細胞存活率的影響Fig 1 Effect of ArBu on cell viability of SGC-7901 cells

3.2 細胞形態變化

ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，與對照組相比，ArBu中濃度組（0.4 μmol·L-1）的細胞和線粒體失去正常形態，明顯變形皺縮，線粒體嵴消失，線粒體和部分細胞死亡；與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比，ArBu聯合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）與對照組細胞形態無明顯差異，線粒體并未皺縮變小（見圖2）。

圖2 顯微鏡（×200）和透射電鏡（×7000）下0.4 μmol·L-1 ArBu以及聯合5 μmol·L-1 Fer-1處理SGC-7901細胞24 h后的細胞和線粒體形態圖Fig 2 Morphology of cells and mitochondria of SGC-7901 cells treated with 0.4 μmol·L-1 ArBu or combined with 5 μmol·L-1 Fer-1 for 24 h under microscope（×200）and transmission electron microscope（×7000）

3.3 ArBu對SGC-7901細胞GSH、SOD、MDA和總Fe水平的影響

ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，與對照組相比，細胞內GSH和SOD水平明顯降低（P＜0.01），MDA和總Fe水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且都呈現出濃度依賴性；與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，ArBu聯合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）細胞內GSH和SOD水平顯著升高（P＜0.05），MDA和總Fe水平顯著降低（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 ArBu對SGC-7901細胞GSH、SOD、MDA和總Fe水平的影響Fig 3 Effect of ArBu on GSH，SOD，MDA and total Fe levels in SGC-7901 cells

3.4 ArBu對SGC-7901細胞脂質ROS水平的影響

ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，與對照組相比，峰顯著右移，熒光更強，且呈濃度依賴性，與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，ArBu聯合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）峰明顯左移，熒光較弱（見圖4A）。細胞內脂質ROS水平變化見圖4B，與對照組相比，ArBu處理組細胞內脂質ROS水平明顯升高（P＜0.01），且呈濃度依賴性。與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，0.4 μmol·L-1ArBu聯合Fer-1（5 μmol·L-1）組細胞內脂質ROS水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 ArBu對SGC-7901細胞脂質ROS水平的影響Fig 4 Effect of ArBu on lipid ROS levels in SGC-7901 cells

3.5 ArBu對SGC-7901細胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑相關蛋白表達的影響

與對照組相比，ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，Nrf2、HO-1、SLC7A11、FTH1和GPX4的表達水平均降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（見圖5）。說明ArBu能通過Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑誘導SGC-7901細胞鐵死亡。

圖5 ArBu對SGC-7901細胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑相關蛋白表達的影響Fig 5 Effect of ArBu on the expression of Nrf2-HO-1/SLC7A11 pathway-related proteins in SGC-7901 cells

4 討論

GC占全球新發腫瘤病例的6%，我國是GC患者最多的國家，在2020年有47.85萬新發病例，37.38萬死亡病例，占全球GC新發病例和死亡病例的44.0%和48.6%[1]。尋找有效、安全、低毒的抗GC藥物已成為應對這一威脅的主要策略。

近年來越來越多的天然藥物單體被發現有治療GC的潛力。蟾蜍毒的主要活性成分ArBu是一種天然甾體化合物，已被證明能在體內外抑制多種細胞和腫瘤增殖，顯示出了良好的廣譜抗腫瘤活性。ArBu可作用于非小細胞肺癌（NSCLC）PC-9細胞和A549細胞，可引起染色質固縮、核碎裂和凋亡小體的形成[15-16]。ArBu還可通過干擾信號通路誘導細胞凋亡和抑制血管生成，Zhang等[17]發現ArBu能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導肝癌細胞HepG2凋亡，Li等[18]發現通過VEGFR-2信號通路，ArBu可以抑制VEGF介導的血管生成，抑制血管內細胞遷移和侵襲以及人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的形成。本研究通過CCK-8法發現，ArBu能顯著降低SGC-7901細胞的存活率且具有時間和濃度依賴性，24 h和48 h的IC50值僅為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1，顯示ArBu具有良好的抗腫瘤細胞活性。

鐵死亡領域自從被發現以來就被聯想到與腫瘤相關，鐵死亡的化學誘導劑也是在尋找新的抗腫瘤化合物過程中發現的[19-20]。鐵死亡的起始和執行與氨基酸、脂質和鐵代謝調節都有聯系，受到多種分子機制的調控。

當0.4 μmol·L-1ArBu與5 μmol·L-1鐵死亡特異性抑制劑 Fer-1聯用時，24 h和48 h的細胞存活率明顯升高（P＜0.01），說明ArBu抑制SGC-7901細胞增殖可能與鐵死亡相關。用顯微鏡和透射電鏡觀察細胞和線粒體的形態變化時發現，與對照組相比，ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，細胞和線粒體明顯變形皺縮，部分細胞死亡，線粒體嵴消失；但當Fer-1聯合ArBu處理SGC-7901細胞24 h，細胞形態與對照組無明顯差異，線粒體并未皺縮變小；并且氧化應激相關指標GSH、SOD、MDA、總Fe和脂質ROS的水平的變化，也證實了ArBu能誘導SGC-7901細胞發生鐵死亡。

Nrf2是控制細胞氧化還原、動態平衡和炎癥的關鍵轉錄因子，同時與鐵死亡氧化應激通路密切相關，Nrf2作為轉錄因子促進SLC7A11和GPX4的表達，還調控下游的靶基因HO-1和FTH1[14，21-22]。GPX4對鐵死亡起到至關重要的調控作用，GPX4和細胞膜上的胱氨酸/谷氨酸轉運受體（System Xc-）以及各種鐵死亡相關蛋白是通過影響ROS代謝發揮其功能的，GSH是GPX4催化脂質過氧化物還原過程的主要輔助因子[23]。System Xc-由SLC7A11和 SLC3A2組成，能夠使細胞內谷氨酸和細胞外胱氨酸進行1∶1交換[24]，進入細胞內的胱氨酸可被還原成半胱氨酸，參與GSH的合成。抑制System Xc-會導致GSH耗竭并間接誘導GPX4失活，最終導致ROS聚集，誘發鐵死亡[9]。Western blot結果顯示，ArBu處理細胞24 h后，Nrf2、SLC7A11和GPX4的表達水平明顯下降，可能是ArBu抑制了Nrf2的表達，Nrf2又下調了SLC7A11和GPX4的表達，而下調SLC7A11的表達會耗竭GSH，進一步抑制GPX4，GSH的試劑盒檢測結果也顯示ArBu能顯著降低GSH水平。

HO-1是一種重要的抗氧化酶，主要催化血紅素分解代謝成亞鐵、一氧化碳和膽綠素：一方面，血紅素基團的降解有利于阻止其促氧化作用；另一方面，副產物膽綠素及其還原型膽紅素具有有效ROS清除活性[25-27]。HO-1是細胞鐵離子的重要來源，在鐵死亡誘導劑erastin誘導的細胞死亡中，可以使膜脂質過氧化誘導細胞發生鐵死亡[28]。鐵蛋白輕鏈（FTL）和FTH1可以將細胞中多余的鐵儲存在胞質中[29]，FTL和FTH1的失活會導致細胞內鐵離子濃度因代謝失衡而升高。本研究結果顯示ArBu處理細胞24 h后，HO-1和FTH1的表達水平顯著降低，Nrf2表達的抑制可能下調了下游HO-1和FTH1的表達，從而導致鐵穩態失衡，細胞內亞鐵離子濃度升高發生芬頓反應。

GPX4的抑制和芬頓反應都會產生大量ROS，HO-1的抑制導致無法有效清除ROS，進一步加劇了ROS的大量蓄積，流式細胞術也證實了ArBu處理SGC-7901細胞24 h后，脂質ROS水平顯著升高，而ROS的蓄積最終誘發細胞鐵死亡。

綜上，ArBu能抑制Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑，破壞SGC-7901細胞的抗氧化應激系統，使細胞內鐵代謝和GSH代謝失衡，亞鐵的大量存在導致芬頓反應發生，GSH的耗竭使GPX4失活，HO-1的抑制使ROS無法有效清除，最終導致ROS蓄積，誘發鐵死亡，抑制SGC-7901細胞增殖。本研究表明ArBu對SGC-7901細胞具有良好的抗腫瘤活性，為ArBu治療GC提供了實驗依據。