循環腫瘤細胞與循環腫瘤DNA在肝細胞癌中的研究進展

楊小周 張靈強 王凱強 王晶晶 樊海寧 陽丹才讓

據統計，全球每年新增的癌癥病例有1 810萬例，因癌癥死亡的患者有960萬例，其中肝癌每年約新增確診病例84.1萬例，肝癌死亡患者約42.21萬例，嚴重威脅到人類的健康[1,2]。肝細胞癌(HCC)作為世界范圍內最常見的消化系統惡性腫瘤，早期預后良好，因此高危人群進行早期診斷對于降低病死率具有重要意義。目前，HCC診斷主要依靠影像學、血清甲胎蛋白以及活體組織檢測；然而影像學和血清檢查在診斷中的準確性和敏感性存在局限性，而活體組織檢查因其有創性、存在種植轉移風險而受到臨床應用的限制[3]。因此，找到一種可靠的方法用來檢測早期HCC并檢測腫瘤復發是至關重要的。近年來，液體活檢標本檢查技術在癌癥的早期篩查診斷方面展現出一定的優勢，是指對血液或其他液體進行微創和非侵入式檢查，可以得到患者腫瘤的遺傳信息[4]。因此，液體活檢在早期診斷、預測治療反應、監測疾病復發、識別靶向治療的耐藥機制等方面具有重要的臨床意義。液體活檢的腫瘤信息來源包括循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環腫瘤細胞(CTCs)以及來自體液(如血清、血漿、尿液、唾液等)的循環miRNAs以及循環外泌體，其中ctDNA/cfDNA是最常見用于分析的生物標志物[5,6]。本文重點介紹作為液體活檢重要成分的CTCs和ctDNA對于HCC診斷、預后以及治療中的臨床應用和價值。

1 CTCs

1.1 CTCs概述 CTCs通常被認為是腫瘤的“種子”，它可以隨著人體內循環從腫瘤的原發性病灶進入到外周循環中并最終轉移至其他器官上形成轉移性腫瘤[7]。理論上而言，循環腫瘤細胞是有效的早期腫瘤標記物。1869年，Ashworth[8]首次從乳腺癌患者血液中證實了CTCs的存在。隨后，許多專家和學者對Ashworth的發現進行了驗證，從各種癌癥患者的外周血中發現了CTCs。CTCs的數量與腫瘤負荷呈正相關，肝細胞癌分期越早，CTCs的數量就越少。CTCs在人血液中存在的時間較短(半衰期：1～2.4 h)，因此若原發性腫瘤在切除之后的數月或數年還能夠在患者血液中檢測到CTCs則證明腫瘤復發或發生了轉移。從全血中獲取CTCs較為復雜，但是從CTCs中能夠獲取腫瘤細胞DNA、RNA以及蛋白質水平等相關信息。即便如此，將CTCs應用于臨床腫瘤特性監測仍然具有一定的局限性，主要是由于CTCs在進入血液循環后，會受到血流動力學的剪切力、細胞外基質的黏附力、機體免疫系統的攻擊以及靶向治療藥物等作用的影響發生凋亡，能夠幸存并釋放到血液中的CTCs僅有不到0.01%能夠產生轉移[9]。上述原因會使利用CTCs作為早期癌癥診斷產生一定的局限性。因此，當前迫切需要一種具有高靈敏度、高特異性的檢測技術能夠擴大CTCs 的臨床適用性。

1.2 CTCs的分離、富集與檢測方法

1.2.1 物理方式：根據CTCs的物理特性，如大小、密度、變性能力、遷移能力以及自身附帶的電荷情況進行分離。Low等[10]首次報道了按照上皮腫瘤細胞大小分離HCC患者血液中CTCs的方式，即細胞過濾技術(ISET)；通過細胞形態學分析，他們證實了外周血中CTCs自發循環能夠反映出肝癌患者腫瘤的發展和擴散情況。另一種方式是密度梯度離心法(DGC)，主要是根據CTCs與血細胞的密度差異，采用了Ficoll密度梯度進行離心分離。Mohamed等[11]設計了一種微加工設備，由4個依次變窄的通道陣列形成，能夠在不受到血細胞干擾的情況下分離出CTCs。但是不同患者或不同癌癥類型的較大差異，部分血細胞也可能會表現出與CTCs相似的物理性質，因此利用上述物理分離方式的假陽性率較高，這也導致物理方式檢測CTCs具有一定的局限性。

1.2.2 生物性質分離：這種方法主要依靠抗原-抗體結合以及抗腫瘤特異性生物標志物的抗體，包括上皮細胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生長因子受體2 (HER2)、前列腺特異性抗原(PSA)等的表達來識別CTCs。目前Cell-Search TM是使用率最高的CTCs檢測系統，也是唯一一種美國食品藥品監督管理局批準的CTCs檢測系統。該系統將EpCAM作為作為CTCs純化最常用的抗原，主要是因為它在上皮來源的細胞中幾乎普遍表達，而血細胞中不存在。曹旻璐等[12]探討了Cell Search系統與qRT-PCR平臺對于HCC患者CTCs檢測性能，證實了其作為一種臨床指標在肝炎和肝癌患者中的表達變化以及發病機制的研究中具有重要的意義。

總而言之，在實際應用中捕獲CTCs可能會用到多種不同的方式，包括特異性較差的富集步驟與物理方式的組合；以及較特異的分離技術，包括熒光原位雜交(FISH)、微陣列、免疫熒光、測序、流式細胞術以及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)等[7]。但是在肝細胞腫瘤患者中，僅有<20%的患者對上皮細胞黏附分子顯現陽性。作為一種替代性技術，研究人員于2017年開始研究一種新興的微流體技術以建立起更好的微型CTC隔離系統。當時開發了一種所謂的CTCs芯片用來捕獲稀有的CTCs。CTCs芯片具有增強CTCs之間相互作用、功能化表明以及阻止非特異性結合的動態流動優勢[13]。如今，CTCs芯片以發展至第三代，主要是以CTC-iChip為代表，包括Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy和Fluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集，這類芯片將免疫磁珠和微流控富集技術相結合，捕獲效率遠高于第一代芯片，為 90% 左右。因此目前已經有各種各樣的技術可以用于收集并分離CTCs，這對于癌癥的研究而言是非常有幫助的，當然其中的大多數技術還有待進一步驗證和實驗才能夠投入臨床使用。

1.3 CTCs在肝細胞腫瘤中的臨床應用

1.3.1 CTCs在肝細胞腫瘤診斷中的應用：隨著腫瘤轉移機制研究的深入以及檢測技術的進步，研究人員能夠使用液體組織活檢技術從一份簡單的血液樣本中就能檢測到CTCs[14,15]。由于CTCs原本就來源于原發性實體腫瘤，因此CTCs可以作為一種非侵入式的病理學方法用于檢測和評估肝細胞癌類型及腫瘤所處階段，重復收集與分析CTCs也可以對疾病的進展以及患者的病情進行實時監控[16]。Zhen等[17]利用流式細胞技術檢測了肝細胞腫瘤患者血液樣本中的CD45和CD90細胞分布的情況，發現檢測率達到了90%，而正常患者和肝硬化患者的血液中未檢出CTCs。上述實驗說明了CTCs液體活檢對于早期肝癌患者的診斷具有一定的應用意義。尤其是當腫瘤原發性病灶難以被傳統檢測手段識別到的時候，可以通過檢測患者外周血內的CTCs來提前預防肝癌的發生，為肝癌的預防和早期介入治療提供了依據，能夠提高患者的存活率[18-20]。一項薈萃分析結果指出，CTCs計數用于診斷肝細胞腫瘤的總體ROC曲線面積能夠達到0.93(95% CI：0.90～0.95)，而且CTCs陽性與無復發幾率以及生存率之間均存在一定的相關性，這說明CTCs計數能夠在肝細胞腫瘤診斷中起到一定的作用[21]。Court等[22]利用Nano Velcro檢測平臺并選取聚糖蛋白-3、脫唾液酸糖蛋白以及EpCAM當做腫瘤的特異性標志物，并從患者血液中分離并富集CTCs，結果有97%的肝細胞腫瘤患者血液中能夠檢測出CTCs，且CTCs技術在鑒別和診斷癌癥患者與健康人群的診斷靈敏度與特異度能夠達到0.842和0.885。

1.3.2 CTCs在肝細胞腫瘤預后評價中的應用：CTCs是從癌癥患者腫瘤細胞中脫離出去的細胞，因此與癌癥細胞的生物學特性一致，同樣具有癌細胞的增殖、侵襲和轉移的能力[23]。因此，腫瘤患者在進行了外科切除手術或其他治療后仍然能夠檢測出CTCs，很大程度上可以確定患者存在高復發可能以及腫瘤轉移的可能，這也說明CTCs計數能夠用于腫瘤預后評價。以往的研究認為，腫瘤患者外周血中一旦能夠檢測出CTCs，則證明患者預后不良。Liu等[24]利用cell-search系統檢測了一些肝細胞腫瘤患者外周血中的CTCs數，并對比了CTCs計數與患者腫瘤預后的聯系，結果發現手術后患者外周血中存在CTCs的患者具有較高的復發風險與轉移風險，存活率較低。Vona等[25]的報道中指出，若患者外周血中的CTCs計數>4，其生存周期一定小于外周血中無CTCs的患者。Schulze等[26]借助cell-search系統并以EpCAM細胞作為特異標志物對59名肝細胞腫瘤患者的血樣進行檢測，結果證明患者血液中的CTCs數目與患者的生存周期存在著極大的相關關系。

2 循環腫瘤DNA(ctDNA)

2.1 循環腫瘤DNA概述 1948年，法國科學家Metais和Mandel在人體循環中發現了游離的DNA，游離DNA(cfDNA)屬于一種胞外DNA，且無論是癌癥患者還是健康人群的外周血中均能找到cfDNA[27,28]。但不同的是癌癥患者的血液樣本中的cfDNA主要是由癌細胞的凋亡或者CTCs的裂解以及增殖旺盛的腫瘤細胞中游離出來的，且主要是由DNA、mRNA和miRNA組成。那么，將這些因為腫瘤細胞而產生且釋放到血液中的游離DNA專門稱為循環腫瘤DNA(ctDNA)。1977年，Leon等[29]在癌癥患者血清中發現了cfDNA，他們認為這可能是臨床療效的指標，且在放療后可見cfDNA水平下降。有學者在1989年發現了具有癌癥特征的ctDNA，這說明腫瘤細胞會將DNA釋放到患者血液循環中[30]。這一疑問在腫瘤患者的血漿中得到驗證:胰腺癌患者的KRAS突變和白血病患者的NRAS突變。當前已經有越來越多的研究證明，利用ctDNA中的某些特異性突變基因，就可以對患者的腫瘤負荷、疾病情況以及藥物應答作出判斷[31]。如今腫瘤分子學的不斷發展與進步，也幫助科學家們更好地研究ctDNA與癌癥的關系，也得到了腫瘤組織內的細胞較人體正常細胞，具有高度的異質性，所以穿刺檢測方法并不能很好地了解到腫瘤內部的全部信息，因此科學界亟需一種更加準確的生物標志物來對腫瘤進行更加準確和詳細的監測。此時，ctDNA的突變檢測得到了青睞，ctDNA的突變檢測彌補了穿刺檢測無法實時和全面監測腫瘤細胞的缺陷，還能夠參與到腫瘤早期診斷、預后評價以及藥物應答監測等多個方面，可以說能夠作為一種非常高效的腫瘤管理方式[32]。此外，ctDNA獲取方式簡單，只需要簡單的采集血液樣本就可以分離得到，這一優點便于其在臨床診療中進行推廣與應用，因此可以預測其將成為未來腫瘤診斷中較為廣泛的一種方式。

2.2 ctDNA的定量和定性分析

2.2.1 ctDNA的定性分析：ctDNA主要是由腫瘤細胞凋亡后釋放，主動或被動進入循環中且主動釋放是主要形成途徑。然而關于ctDNA的形成途徑以及ctDNA與cfDNA的比例目前尚不明確，大多數的研究結果為3%～93%，隨著目前檢測技術的進步已經能夠檢測到0.01%的ctDNA[33]。二者的比例差距較大的原因在于ctDNA僅占cfDNA的0.1%～5%，且不同癌種、不同病程的腫瘤患者ctDNA在血漿中含量差異較大；其次，cfDNA一進入循環系統，很快就會被自身免疫系統清除，因此能夠檢測到的cfDNA數量很少；最后ctDNA擅長偽裝，它與正常cfDNA片段之間的差異極小，可以藏匿在很多的cfDNA中，難以辨別[34]。但是能夠確定的是腫瘤患者較健康人群外周血中的cfDNA水平更高，這一數量還隨著腫瘤壞死體積以及轉移灶的數量上升而不斷增大，說明患者血液中ctDNA的水平與病情之間有一定的關系。但是健康人群血液中的cfDNA水平有時候也會因人所處的生理狀態的不同而有所變化，比如女性妊娠以及劇烈運動后都會導致血液中cfDNA水平上升。

從人血漿中分離并富集的循環中的cfDNA主要是以200 bp短片段為主，且這一特征在腫瘤患者和健康人群中是一樣的，均處于166 bp上下。因此通過富集cfDNA有利于檢測ctDNA的檢測準確性[35]。

2.2.2 ctDNA的定量分析：ctDNA定量分析可以應用在腫瘤的負荷判決，ctDNA的定量包含ctDNA濃度和特定基因片段的突變負荷率的定量。以往的研究中，ctDNA定量一般是基于定量PCR技術，然而這種方法僅僅能判斷循環中的核酸片段濃度，并不能鑒別所有游離DNA中的哪些是來源于腫瘤的ctDNA。隨著當前新的測序技術的進步，ctDNA檢測變得簡單，可以通過對cfDNA進行測序以及對其中特定的突變基因進行靶向擴增已實現ctDNA的定量檢測。這種方法主要是利用基因外顯子捕獲技術對患者血漿先捕獲再測序，測序區域一般集中在腫瘤的變異區域，就避免了對全部的基因組序列進行測度，這樣能夠更快檢測到腫瘤中特異性的低頻突變基因[36]。現在已經出現了很多研究結果證明了靶向測序檢測ctDNA的準確性和可行性，并且還得到了不同腫瘤基因的panel組合，可以作為常見的癌癥突變基因靶向測序，這一方法將成為未來ctDNA檢測的主要方向之一[37]。除此之外，利用數字PCR技術檢測ctDNA也被大量報道，數字PCR技術的檢測靈敏度非常高，能夠對腫瘤基因中單個的突變分子進行定量檢測，可以運用在血漿中僅存在少數低頻突變基因時候的檢測，這對于早期腫瘤患者的診斷和耐藥性檢測具有很大的臨床應用價值。

2.3 ctDNA在肝細胞腫瘤中的臨床應用

2.3.1 ctDNA在治療中的應用：實際的臨床治療中，醫生通常會依據AFP變化以及影像學等結果來作為檢測肝細胞腫瘤病灶存活或復發等情況，然后再對病灶開展相應的治療。然而AFP的檢測準確性并不高，約有30%的肝癌患者AFP檢測為陰性，而影像學也容易受到碘油沉積、腫瘤灌注以及檢測人員的經驗等導致檢測準確性有所差別，因此肝癌的臨床診斷缺乏統一的指標來明確化確診[38]。有大量的研究結果證明了ctDNA與腫瘤發展狀況以及患者的預后等有關。丁巍等[39]探討了原發性肝癌患者術后外周血ctDNA水平變化對于患者術后及預后狀況的判斷，于術后1個月檢測外周血ctDNA表達水平并隨訪2年，發現與傳統的檢測方式相比，ctDNA能夠更早檢測到乳腺癌術后復發情況；并且長期的隨訪發現ctDNA表達水平在預測肝癌患者預后的最佳截斷值為64.89 ng/ml (敏感度=79.80%,特異性=87.10%)。Tang等[40]繪制了肝細胞腫瘤的ctDNA監測曲線用來展示患者在不同時期的ctDNA變化水平，結果顯示肝細胞腫瘤患者治療前，腫瘤處于快速增殖時期，此時ctDNA的水平也在快速增加；經過治療后腫瘤負荷得到了緩解或消失，此時ctDNA的水平也在快速下降，而患者一旦復發，ctDNA水平將再次急劇上升。這一結果證明，監測ctDNA的變化曲線能夠及時掌握肝細胞腫瘤的情況，能夠幫助醫生更好地評估患者病情以及作為評估病灶存活與復發的DNA標志物。

2.3.2 ctDNA在預后判斷中的應用：ctDNA的甲基化分析能夠提高早期腫瘤診斷準確性并對預后監測有重要意義。Wong等[41]發現，有92%(23/25)的患者體內能夠檢測到P15和P16基因甲基化，但是作為對照的慢性肝炎、肝硬化、健康人群的體內均未檢測到；研究還指出腫瘤組織和血漿cfDNA一致性甲基化變異的患者腫瘤病灶轉移的可能性更高；通過對血漿cfDNA進行全基因組測序后，可判斷發現原發性肝癌患者在術前與術后是否存在殘癌。已有的研究中，除了對特異性基因進行檢測，也有分析血漿cfDNA濃度與患者腫瘤負荷、預后相關性的研究[42]。Chan等[43]對39例原發性肝細胞腫瘤患者進行了研究，對比了單獨依賴cfDNA濃度作為肝癌檢測指標的敏感性為56.4%；而利用cfDNA濃度聯合甲胎蛋白作為依據的檢測敏感性可達71.8%；利用cfDNA濃度聯合巖藻糖苷酶檢測敏感性可達87.2%；將cfDNA濃度、甲胎蛋白、巖藻糖苷酶三者聯合用于檢測，敏感性達到了89.7%，這說明聯合甲胎蛋白、巖藻糖苷酶能夠提高原發性肝癌診斷的準確性和靈敏性。由于研究中采用的檢測方法不一致，因此這些方法得到的結果尚有一些缺陷，無法作為確定cfDNA濃度與原發性肝癌之間關系的可靠性依據。

利用循環腫瘤細胞和循環腫瘤DNA診斷和評估肝細胞腫瘤具有重要的臨床價值。目前CTCs用于肝細胞腫瘤檢測主要還存在一些問題，主要是富集方法不夠高效、CTCs檢測的特異性有待加強、對于實驗條件和設備的要求比較高等。而ctDNA為肝細胞腫瘤診斷提供了一個實時監測腫瘤負荷以及基因變異特征的非侵入式檢測方式。未來CTCs檢測和ctDNA檢測將得到不斷的完善和技術積累，必然能夠在肝細胞腫瘤臨床診斷中得到更加廣泛的應用，從而使患者獲益。