CD68和CD166在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

武會斌 王皇建 王云帥 夏添明 李朝輝 韓保衛

雖然近年來腫瘤診治技術取得了巨大進展，但由于晚期復發和轉移，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的5年生存率依然很不滿意[1]。因此，研究與CRC進展相關的分子標志物，尋找新的治療靶點，在改善CRC患者的預后中具有重要意義。腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)由腫瘤細胞、血管內皮細胞、免疫細胞和細胞外基質等間質成分及其分泌的細胞因子構成[2]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是TME中最豐富的免疫細胞群[3]，腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSCs)生態位也是TME的重要組成部分[4]。因此，本研究應用免疫組化的方法檢測TAMs標志物CD68和CSCs標志物CD166在結直腸癌組織和癌旁正常組織中的蛋白表達水平，探討其與臨床病理特征及預后的關系，旨在為CRC的治療及預后判斷提供重要參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2019年10月在鄭州大學附屬洛陽中心醫院接受手術治療的CRC患者148例。其中男84例，女64例；年齡32～87歲，中位年齡62歲；結腸癌65例，直腸癌83例；腫瘤直徑<5 cm者78例，≥5 cm者70例；無淋巴結轉移者111例，有淋巴轉移者37例；高分化23例，中分化111例，低分化14例；采用AJCC/UICC結直腸癌TNM分期系統(2017年第八版)[5]對CRC進行分期：T1期15例，T2期29例，T3期67例，T4期37例；Ⅰ期43例，Ⅱ期61例，Ⅲ期33例，Ⅳ期11例。本研究已通過洛陽中心醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①術前未接受放療或化療等抗腫瘤治療；②均進行CRC根治術，術后病理學證實為結直腸腺癌；③臨床資料完整。

1.2.2 排除標準：①合并其他部位原發性惡性腫瘤者；②術前或術后嚴重感染影響預后者；③隨訪失訪者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器與試劑：倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，免疫組織化學油筆購自Doko公司，抗原修復微波爐購自廣東順德格蘭仕公司，孵育盒購自福州邁新生物技術有限公司。兔抗人CD166單克隆抗體、兔抗人CD68單克隆抗體購自美國Abcam公司，二抗購自BOSTER生物公司，DAB顯色試劑盒購自上海長島診斷試劑有限公司。

1.3.2 癌組織及癌旁正常組織CD68+TAMs、CD166+CSCs表達檢測：免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術(SABC法)。取手術切除癌組織及配對的癌旁正常組織標本(距癌組織邊緣>5 cm)，體積分數10%甲醛固定12 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，60℃下烤片60 min，常規脫蠟水化。3%雙氧水覆蓋玻片，避光、室溫下封閉10 min，滅活內源性過氧化物酶，雙蒸水沖洗3次。玻片完全浸潤于檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值6.0)中，微波爐抗原修復15 min，室溫冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗10 min。免疫組化筆圈出組織固定范圍，用山羊血清封閉液覆蓋玻片，室溫封閉孵育20 min后，滴加一抗，冰箱4℃孵育過夜。PBS沖洗15 min，滴加二抗，SABC試劑覆蓋切片，37℃下封閉20 min，PBS沖洗10 min。新鮮DAB適度染色，蘇木精復染30 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。用已知陽性片作對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片在光鏡200倍鏡下隨機觀察3個具有代表性的視野拍攝照片。CD68染色定位于TAMs的胞膜或胞漿，CD166染色定位于CSCs的胞膜或胞漿。根據染色強度和(或)陽性細胞所占比例，采用半定量計分法判定免疫組化染色結果。染色程度：陰性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性范圍：<5%為0分，5%～24%為1分，25%～50%為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分。將上述2項評分相加作為最終評分結果：0分為陰性，<4分為低表達，≥4分為高表達。

1.3.3 隨訪：通過電話和復診病歷進行隨訪，計算患者的總生存期(overall survival，OS)。OS定義為從手術次日開始，至因任何原因引起死亡的時間。隨訪時間為3～72個月，中位隨訪時間為36個月，截止時間為2020年1月31日或死亡。連續2次無法聯系定義為失訪，失訪率為9.5%。

1.4 統計學分析 應用SPSS 25.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關，Kaplan-Meier法及Log-Rank檢驗進行生存預后分析，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC患者癌組織與癌旁正常組織CD68+TAMs、CD166+CSCs陽性表達率比較 CRC患者癌組織CD68+TAMs[49.3%(73/148)]、CD166+CSCs[52.7%(78/148)]陽性表達率均高于癌旁正常組織[9.5%(14/148)、6.8%(10/148)]，差異均有統計學意義(χ2值分別為56.667、74.776，P<0.05)。見圖1。

2.2 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達與結直腸癌患者

CD68+TAMs在癌旁正常組織中的表達 CD68+TAMs在癌組織中的表達 CD166+CSCs在癌旁正常組織中的表達 CD166+CSCs在癌組織中的表達

臨床病理特征的關系 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及分化程度密切相關，差異有統計學意義(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度無關(P>0.05)。見表1。

表1 結直腸癌患者各分組與臨床病理特征之間的關系 例

2.3 結直腸癌組織中CD68+TAMs和CD166+CSCs表達水平的相關性 Spearman相關性分析顯示，結直腸癌組織中CD68+TAMs和CD166+CSCs的表達水平呈明顯正相關(r=0.777，P<0.01)。見表2。

表2 結直腸癌組織中CD68+TAMs與CD166+CSCs表達水平的相關性 例

2.4 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達分組與患者生存期之間的關系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CD68+TAMs、CD166+CSCs無高表達組(n=88)的5年生存率為69.0%，單一高表達組(n=21)的5年生存率為49.4%，均高表達組(n=39)的5年生存率為20.3%，差異有統計學意義(Log-rank χ2=26.743，P<0.05)。見圖2。

圖2 CD68+TAMs和CD166+CSCs表達分組與患者生存期的關系

2.5 預后影響因素 單因素分析顯示，腫瘤大小(HR=2.404，95%CI=1.261～4.585，P=0.008)、淋巴結轉移(HR=2.432，95%CI=1.353～4.373，P=0.003)、TNM分期(HR=3.553，95%CI=1.927～6.550，P<0.001)、CD68+TAMs和CD166+CSCs聯合分組(HR=3.999，95%CI=2.024～7.900，P<0.001)與CRC患者的OS有關，而性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度與患者的OS無關(P>0.05)。把單因素分析有統計學意義的變量納入Cox多因素回歸模型進行危險因素分析，淋巴結轉移(HR=0.340，95%CI=0.125～0.925，P=0.035)、TNM分期(HR=4.496，95%CI=1.694～11.932，P=0.003)、CD68+TAMs和CD166+CSCs聯合分組(HR=2.856，95%CI=1.364～5.983，P=0.005)是影響OS的獨立危險因素，而腫瘤大小(HR=1.542，95%CI=0.666～3.572，P=0.312)并非影響OS的獨立危險因素。見表3。

表3 結直腸癌患者的預后影響因素分析

3 討論

CRC的發生發展是多因素、多環節、多階段參與的復雜過程，在此過程中，CRC細胞及其周圍環境構成了特異性的TME。CRC細胞與TME中的多種成分相互串擾、協同作用，從而促進其發生發展[6]。有關TME的研究已成為當前抗癌研究領域的熱點之一[7]。TAMs和CSCs作為TME中的關鍵作用者，已被發現在多種腫瘤的進展中起著至關重要的作用[2,8]。

不同的微環境可能導致兩種不同極化的TAMs：經典激活型(M1型)和替代激活型(M2型)。M1型TAMs被認為是促進炎性反應和抗腫瘤活性，而M2型TAMs則是扮演著抑制炎性反應和促進腫瘤惡性生長的負面角色，二者可以相互轉化[9]。既往研究表明，TME中TAMs的表型和功能與M2型相似，通過促進腫瘤血管和淋巴管的生成，抑制T細胞功能，增強腫瘤細胞化療藥物抗性等來發揮促癌效應[10-12]。Kim等[13]通過對584例CRC組織的免疫組化結果進行分析，發現腫瘤組織中高密度的CD68+TAMs與CRC患者TNM分期晚及預后差顯著相關。本研究結果顯示，CRC癌組織中CD68+TAMs表達陽性率明顯高于癌旁正常組織，提示CD68+TAMs表達上調與CRC的發生、發展關系密切。此外，本研究還發現CD68+TAMs的表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、分化程度等顯著相關，而這些臨床病理特征通常代表腫瘤有著更強的侵襲與轉移能力，提示CD68+TAMs高表達的CRC患者預后不良。

CSCs具有極強的致瘤潛力，在體內以較低的數量就可以形成腫瘤，且對化療藥不敏感，被認為是腫瘤復發和轉移的根源[14]。張鈞書等[15]研究發現CD166 陽性表達與腫瘤局部進展和遠處轉移有關，是判斷預后不良的標志，并且CD166 陽性的腫瘤細胞可能具有肝轉移潛能。一項薈萃分析研究顯示，CD166+CSCs在結直腸癌組織中的表達明顯高于結腸腺瘤組織和正常結腸黏膜組織，而且其表達與預后不良相關，有望成為Ⅱ期CRC患者生存的預測性生物標志物[16]。在本研究中，CRC癌組織中CD166+CSCs表達陽性率明顯高于癌旁正常組織，且表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、分化程度等侵襲性腫瘤表型相關，提示CD166+CSCs表達上調后腫瘤的惡性程度變高，易發生浸潤轉移，患者的預后差。

研究表明，TAMs通過分泌轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)誘導上皮—間充質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，使肝癌細胞的CSCs標志物表達上調，成瘤能力增強[17]。在肝內膽管癌中，CSCs可以通過分泌骨膜素等募集大量的TAMs在腫瘤部位浸潤并且維持TAMs的促腫瘤表型[18]。本研究分析了CRC癌組織中CD68+TAMs與CD166+CSCs表達水平的相關性并對其進行了聯合分組。結果顯示，二者表達水平呈明顯正相關，且隨著二者表達率的增加，CRC患者的5年生存率明顯降低。此外，多因素回歸分析顯示，淋巴結轉移、TNM分期、CD68+TAMs與CD166+CSC聯合分組是CRC患者預后不良的獨立危險因素。上述研究結果進一步表明，CD68+TAMs和CD166+CSCs有望作為CRC臨床診療及預后情況判斷的潛在靶點，同時提示TAMs與CSCs在CRC的發生發展中相互誘導并起協同作用。其作用機制可能在于TAMs能分泌某類細胞因子使CRC細胞獲得干性，和(或)CSCs可以產生某類趨化因子以募集更多的TAMs至TME，從而促進CRC細胞生長。

綜上所述，CD68+TAMs和CD166+CSCs在CRC的發生發展中可能起協同促進作用，二者的同時高表達更能提示CRC患者預后不良。聯合檢測二者可進一步提高對CRC患者預后的判斷價值，并指導臨床進行更為精準的治療。