馬齒莧多糖調節PPARγ/NF-κB通路對大鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

譚麗萍 韓鳳珍 胥明霞

動脈粥樣硬化表現為動脈管壁變厚、變硬，管腔狹窄、失去彈性，是心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的病理基礎，高血壓、糖尿病等基礎疾病均可誘發動脈粥樣硬化[1,2]。炎癥、高血脂等在動脈粥樣硬化的發生發展中具有重要作用，因其會引起血液粘度增加、流動性降低，促進動脈粥樣硬化斑塊形成。因此從抗炎、降脂方面入手，尋找動脈粥樣硬化的治療方法是可行方案之一[3]。馬齒莧具有廣泛抗炎、抗氧化活性，研究表明，其可調節高血脂、動脈粥樣硬化[4]。馬齒莧多糖是馬齒莧的主要活性物質，具有豐富的藥理活性，在抗腫瘤[5]、抗氧化[6]中發揮作用。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ)在內皮細胞[7]、平滑肌細胞[8]等血管細胞中含量豐富，對于血管細胞的穩定十分重要，且這些細胞在動脈粥樣斑塊的發展中發揮作用。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是重要的炎癥通路，張華等[9]研究顯示，新塔花通過調控TLR4/NF-κB抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。本研究基于PPARγ/NF-κB通路探討馬齒莧多糖對大鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響，為臨床治療動脈粥樣硬化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級別SD大鼠，體重(180±20)g，購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002)]；馬齒莧多糖(SPB9510，>90%)購自北京索萊寶科技有限公司；PPARγ抑制劑-GW9662(Y98012)購自上海源葉生物；大鼠總膽固醇(TC)(SBJ-R0142)ELISA試劑盒(南京森貝伽)、大鼠三酰甘油(TG)ELISA試劑盒(YT30046)、大鼠低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)ELISA試劑盒(YT30047)購自上海韻泰；C-反應蛋白(CRP)ELISA試劑盒(ml002999)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(ml102828)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒(ml002960)購自上海酶聯生物；兔抗PPARγ(GTX03364)、NF-κB p65(GTX102090)、GAPDH(GTX627408)購自GeneTex；羊抗兔IgG二抗(ab6721)購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組與造模：隨機挑選10只大鼠作為對照組，普通飼料喂養。其余大鼠采用高脂飲食喂養(配方為70%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃、2%膽酸鈉、13%豬油、3%吐溫80)，持續10周，腹腔注射維生素D3溶液(60萬U/kg，注射1次)[10]。隨機選取3只，主動脈組織光鏡下觀察到粥樣斑塊形成，則說明造模成功。剩余50只大鼠按照隨機數字表法分為模型組、馬齒莧多糖低劑量組、馬齒莧多糖高劑量組、GW9662組、馬齒莧多糖高劑量+GW9662組，每組10只。馬齒莧多糖低劑量組灌胃50 mg/kg馬齒莧多糖，馬齒莧多糖高劑量組灌胃200 mg/kg馬齒莧多糖[11]，GW9662組尾靜脈注射1 mg/kg的PPARγ抑制劑-GW9662，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組灌胃200 mg/kg馬齒莧多糖，尾靜脈注射1 mg/kg的GW9662。對照組大鼠灌胃及注射等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，為期4周。

1.2.2 血液及主動脈標本采集及處理：于實驗結束后經腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min后取上清，-80℃保存；解剖大鼠，分離腹主動脈，0.9%氯化鈉溶液清洗后部分組織-80℃低溫保存，甲醛溶液(10%)中固定，部分組織戊二醛溶液(2.5%)固定，分別用于Western blot檢測、形態學、超微結構檢測。

1.2.3 血清中TC、TG、LDL-C、CRP、IL-6、MCP-1測定：ELISA試劑盒檢測大鼠血清TC、TG、LDL-C、CRP、IL-6、MCP-1水平，參照各試劑盒說明書進行。

1.2.4 HE染色檢測大鼠腹主動脈病理情況：10%中性甲醛中取出組織，固定后依次經梯度乙醇(75%～100%)脫水處理，脫水后二甲苯透明，石蠟切片(厚度5 μm)。依次進入二甲苯中，梯度乙醇(100%～75%)脫蠟，切片浸泡入蘇木精染液中，蒸餾水沖洗、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色，蒸餾水沖洗，梯度乙醇(75%～100%)脫蠟，二甲苯中透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察血管壁、管腔情況。

1.2.5 油紅O染色觀測斑塊面積：取1.2.2中冷凍切片，浸入油紅O工作液(15 min)，沖洗干凈后(異丙醇1次，蒸餾水2次)，蘇木素染色5 min，沖洗后1%鹽酸-乙醇溶液分色1 s，封片后在光鏡下觀察。

1.2.6 透射電鏡觀察主動脈超微結構：取1.2.2中戊二醛固定的組織，PBS溶液漂洗3次，1%四氧化鋨溶液中固定2 h，PBS溶液漂洗干凈后乙醇梯度(50%～90%)脫水，環氧樹脂包埋，經38℃、45℃、60℃依次聚合后，超薄切片機切片(60 nm)，碳酸鉛染色，透射電鏡觀察超薄切片脂滴情況。

1.2.7 Western blot檢測腹動脈中PPARγ/NF-κB蛋白情況：取1.2.2中超低溫保存的腹主動脈組織，添加適量(200 μl)蛋白裂解液裂解組織，并充分研磨，冰上靜置(10 min)，12 000 r/min、4℃離心(20 min)，吸取上清液轉至另外的EP管中，BCA法對蛋白定量，經SDS-PAGE凝膠電泳跑膠，PVDF在300 mA條件下轉膜，室溫封閉2 h(5%脫脂奶粉)；加入相應的兔抗鼠一抗PPARγ(1∶500)、p65 NF-κB(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000，以此為內參)；對應加入羊抗兔二抗，稀釋比為1∶5 000，室溫條件下孵育2 h，ECL避光條件下顯色，蛋白凝膠成像儀曝光拍照和定量分析。

2 結果

2.1 6組大鼠血清血脂水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)；與模型組比較，馬齒莧多糖低、高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，GW9662組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)；與馬齒莧多糖高劑量組比較，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 馬齒莧多糖對大鼠血脂情況的影響

2.2 6組大鼠血清炎性質因子水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清CRP、IL-6、MCP-1水平升高(P<0.05)；與模型組比較，馬齒莧多糖低、高劑量組降低(P<0.05)，GW9662組升高(P<0.05)；與馬齒莧多糖高劑量組比較，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組升高(P<0.05)。見表2。

表2 馬齒莧多糖對大鼠炎癥因子的影響

2.3 6組大鼠光鏡下腹主動脈形態學觀察

2.3.1 HE染色顯示：對照組大鼠腹主動脈內膜、中膜、外膜結構完整，光滑、層次清晰；模型大鼠腹主動脈內皮細胞腫脹，內膜增生，出現脂質沉積，可見泡沫細胞；與模型組相比，馬齒莧多糖低、高劑量組內膜增生情況、脂質沉積減輕，GW9662組腹主動脈損傷嚴重；與馬齒莧多糖高劑量組相比，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組腹主動脈損傷加重。見圖1。

對照組 模型組 馬齒莧多糖低劑量組

馬齒莧多糖高劑量組 GW9662組 馬齒莧多糖高劑量+GW9662組

2.3.2 油紅O染色顯示:對照組未發現明顯病理改變，模型組大鼠腹主動脈可見大面積的粥樣斑塊、脂質沉積；與模型組比較，馬齒莧多糖低、高劑量組粥樣斑塊面積減少，GW9662組粥樣斑塊面積增多；與馬齒莧多糖高劑量組相比，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組粥樣斑塊面積增多。見圖2。

對照組 模型組 馬齒莧多糖低劑量組

馬齒莧多糖高劑量組 GW9662組 馬齒莧多糖高劑量+GW9662組

2.4 6組大鼠電鏡下腹主動脈粥樣硬化斑塊形成情況 對照組大鼠主動脈內皮完整，無斑塊形成，可見少量脂滴；模型大鼠腹主動脈內皮細胞丟失，有局部纖維變性和粥樣硬化斑塊形成，可見大量脂滴；與模型組相比，馬齒莧多糖低、高劑量組大鼠腹主動脈內皮細胞損傷較輕，GW9662組大鼠腹主動脈內皮細胞損傷加重；與馬齒莧多糖高劑量組比較，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組腹主動脈內皮細胞損傷加重。見圖3。

對照組 模型組 馬齒莧多糖低劑量組

馬齒莧多糖高劑量組 GW9662組 馬齒莧多糖高劑量+GW9662組

2.5 6組大鼠PPARγ/NF-κB通路蛋白表達情況 與對照組比較，模型組大鼠腹主動脈PPARγ蛋白表達降低、p65 NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，馬齒莧多糖低、高劑量組大鼠腹主動脈PPARγ蛋白表達升高、p65 NF-κB蛋白表達降低(P<0.05)，GW9662組大鼠腹主動脈PPARγ蛋白表達降低、p65NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)；與馬齒莧多糖高劑量組比較，馬齒莧多糖高劑量+GW9662組腹主動脈PPARγ蛋白表達降低、p65 NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)。見表3,圖4。

表3 馬齒莧多糖對大鼠腹主動脈PPARγ/NF-κB通路蛋白的影響

圖4 馬齒莧多糖對大鼠腹主動脈PPARγ/NF-κB通路蛋白的影響；A 對照組；B 模型組；C 馬齒莧多糖低劑量組；D 馬齒莧多糖高劑量組；E GW9662組；F 馬齒莧多糖高劑量+GW9662組

3 討論

動脈粥樣硬化是慢性炎癥進展性疾病，是心肌梗死、腦梗死疾病的病理基礎。動脈粥樣硬化中斑塊的形成、破裂與炎性反應、血管內皮障礙、氧化應激、高血脂所導致的血液流動性變差等關系密切。本研究通過高脂飲食聯合維生素D3注射構建大鼠動脈粥樣硬化模型，所建模型大鼠腹主動脈出現粥樣斑塊，有脂質沉積，血清中TC、TG、LDL-C含量升高，動脈管壁增厚，提示動脈粥樣硬化大鼠出現脂質代謝異常現象，易出現血栓，威脅健康。

馬齒莧是一年生草本植物，中醫學理論認為其性寒，有清熱解毒、散血消腫等功效。體外、體內實驗認為馬齒莧具有廣泛抗腫瘤作用。在糖尿病腎病中，馬齒莧多糖能夠減輕高脂飼料聯合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠氧化應激、炎癥、腎損傷[13]；口服馬齒莧多糖可增強口蹄疫小鼠免疫應答能力[14]；馬齒莧多糖可通過降低HepG2細胞線粒體膜電位、增加細胞內鈣離子濃度，促進細胞凋亡進而發揮抑制肝癌HepG2細胞進展[5]。本研究中經馬齒莧多糖治療后，動脈粥樣硬化模型大鼠血清TC、TG、LDL-C、CRP、IL-6、MCP-1水平下降，脂質沉積、脂滴形成、斑塊面積降低，提示馬齒莧多糖可降低模型大鼠血脂稠度、炎性水平，對大鼠動脈粥樣硬化斑塊具有緩解作用，但馬齒莧多糖是一個多功能、多靶點物質，其對大鼠動脈粥樣硬化斑塊的緩解作用機制仍需進一步探討。

PPARγ是脂肪感受器以及脂肪酸氧化驅動器，通過直接或間接方式參與脂肪酸氧化、脂質代謝與炎癥調節。朱磊等[15]研究顯示，低氧訓練可通過調控miR-27/PPARγ通路參與肥胖大鼠腓腸肌脂肪酸代謝；山奈酚可通過激活PPARγ/LXRα/ABCA1和PPARγ/PI3K/AKT通路穩定高脂飲食喂養的小鼠糖脂代謝紊亂[16]。NF-κB是PPARγ下游的重要分子之一，可被PPARγ激活參與各種炎性活動。p65/p50是NF-κB中含量豐富的表現形式，常以二聚體形式存在，二者因激活解聚后，p65 NF-κB入核，對下游進行調控，可促進細胞外基質沉積，并可調控炎性反應[17,18]。本研究中，模型大鼠PPARγ降低、p65 NF-κB蛋白表達升高，結合大鼠中動脈斑塊形成等結果，提示PPARγ/NF-κB通路在大鼠動脈粥樣硬化斑塊形成中發揮作用。經馬齒莧多糖處理后PPARγ升高、p65 NF-κB蛋白表達降低，在馬齒莧多糖高劑量組基礎上添加PPARγ抑制劑后馬齒莧多糖的抗硬化斑塊形成、抗炎作用被逆轉，進一步提示馬齒莧多糖可能通過激活PPARγ，抑制NF-κB發揮作用。

綜上所述，馬齒莧多糖可能通過調控PPARγ/NF-κB通路抑制大鼠動脈粥樣硬化斑塊形成，進而緩解疾病進展，可能為有效的作用藥物之一。