酒石酸布托啡諾基于JNK/NF-κB信號通路對大鼠腦缺血再灌注損傷的改善作用

趙瑩 趙晶

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是指腦缺血一定時間后再次恢復血液供應，腦功能出現更加嚴重的組織損傷和功能障礙。腦細胞缺血缺氧壞死、再灌注過程引發的炎性反應、腦水腫等病理過程均可引起神經細胞凋亡、壞死，造成患者神經功能缺損，是缺血性卒中發生的主要環節，也是缺血性腦血管疾病患者預后不良的重要因素[1-3]。目前，CIRI尚無特異性防治措施，臨床多以對癥治療為主[4]。因此，深入研究腦缺血再灌注損傷的病理生理機制，尋找防治CIRI的有效藥物具有重要的臨床意義和社會價值。酒石酸布托啡諾(butorphanol tartrate)是一種混合型阿片受體激動拮抗劑，廣泛應用于臨床鎮痛治療[5,6]。有研究報道，酒石酸布托啡諾通過MAPK信號通路和抑制線粒體凋亡對心肌缺血再灌注損傷起保護作用[7,8]。然而酒石酸布托啡諾在CIRI方面的研究尚無明確報道，因此，本研究探究酒石酸布托啡諾對大鼠CIRI的改善作用，并進一步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8～12周齡健康雄性SD大鼠80只，均為清潔級，體重220～240 g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供[(生產許可證號：SCXK(遼)2019-0001]，飼養于室溫(23±2)℃、相對濕度45%～60%、12 h晝夜節律的環境，標準飼料喂養，自由飲水、進食。酒石酸布托啡諾(純度>98%，規格：10 mg,湖北恩星生物科技有限公司)；尼莫地平(純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色試劑盒、蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、TUNEL試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白含量測定試劑盒(碧云天公司)；兔源腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、核因子κB磷酸化65(nuclear factor kappa-B phosphorylation 65，p65)抗體、鼠源β-肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG(美國Cell Signaling Technology公司)；增強型化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(美國Amersham公司)。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIRI動物模型建立：大鼠均適應性飼養1周后，參照改良線栓法[9]構建大鼠CIRI模型，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸外動脈，用血管夾夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈遠心端，在頸外動脈距離頸總動脈分叉約2 mm處剪一小口，將備好的尼龍線栓插入并推至勁內動脈，直至推至中動脈起始部，遇到輕微阻力時停止。缺血2 h后，取出尼龍線栓，恢復血液流動。術后縫合切口，肌內注射20 U青霉素以防感染。待各組大鼠清醒后，按照Zea Longa評分標準[10]評價大鼠神經功能：0分，活動正常，無任何神經缺損癥狀；1分，左側肢體伸展不完全；2分，左前肢屈曲內收，向左側追尾轉圈；3分，行走時向左側傾倒；4分，意識不清，無法行走。神經功能評分在1～3分即表示造模成功，納入實驗。

1.2.2 實驗動物分組及處理：80只大鼠隨機分為假手術組、模型組、酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組，每組20只。其中Sham組大鼠僅分離血管不插入尼龍線栓。其余各組均隨機分配造模成功的大鼠。造模成功24 h后，酒石酸布托啡諾組大鼠靜脈注射50 μg/kg酒石酸布托啡諾，尼莫地平組大鼠靜脈注射0.5 mg/kg尼莫地平，假手術組和模型組大鼠均靜脈注射等劑量0.9%氯化鈉溶液。連續給藥14 d。

1.2.3 大鼠神經功能評分：分別于術后第1天、第14天，參照Zea Longa評分標準對大鼠神經功能進行評估，得分越高表示神經功能缺損越嚴重。

1.2.4 大鼠腦含水量測定：4組隨機取5只大鼠，麻醉后處死取腦，精密稱重大腦組織，即為腦濕重，在100℃恒溫箱烘烤48 h后精密稱重記為腦干重，計算腦含水量。腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.2.5 TTC染色測定大鼠腦梗死體積比：末次給藥12 h后，4組隨機取5只大鼠，麻醉處理取出腦組織，將大鼠腦組織連續2 mm冠狀切片，放入2%TTC染色液中，37℃恒溫孵育30 min，待腦組織顏色分明(正常腦組織為紅色，梗死區域呈現白色)后，置于4%多聚甲醛固定，計算梗死體積比。

1.2.6 HE染色觀察大鼠腦組織病理形態學變化：各組隨機取5只大鼠，麻醉處死，取出腦組織，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋制備厚度為5 μm的石蠟切片，隨后根據HE染色試劑盒說明書進行染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織學變化。

1.2.7 TUNEL法檢測大鼠腦組織中細胞凋亡：取大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟至水，滴加蛋白酶K溶液，室溫孵育20 min，根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作步驟染色，封片，置于顯微鏡下觀察，胞漿中帶有棕色底物的細胞為凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.2.8 Western blot法檢測大鼠腦組織中炎性因子蛋白表達和JNK/NF-κB信號通路相關蛋白表達：分別于各組取5只大鼠，麻醉處死，取出腦組織，選取右側梗死區大腦皮質組織，加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取定量蛋白經SDS-PAGE電泳分離，然后轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，洗膜后，加入TNF-α、IL-1β、IL-6、JNK、p-JNK、NF-κB、p65、β-actin一抗(1∶500)，4℃條件下孵育過夜，洗膜3次，加入HRP標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL發光試劑，以β-actin為內參蛋白，分析目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 4組CIRI大鼠神經功能評分比較 與假手術組比較，模型組大鼠術后第1天、第14天神經功能評分均顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組大鼠術后第1天神經功能評分均無顯著性變化(P>0.05)，術后第14天神經功能評分均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組CIRI大鼠神經功能評分比較 n=20，分，

2.2 4組CIRI大鼠腦含水量和腦梗死體積比比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦含水量和腦梗死體積比均顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組大鼠腦含水量和腦梗死體積比均顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 4組CIRI大鼠腦含水量和腦梗死體積比比較

假手術組 模型組 酒石酸布托啡諾組 尼莫地平組

2.3 4組CIRI大鼠腦組織病理性形態比較 假手術組大鼠神經元結構完整，排列整齊，無明顯病變。模型組大鼠腦組織神經元排列紊亂，細胞間隙增大，胞體腫脹變形、核仁變淺或缺失，可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組大鼠腦組織神經元病變改善明顯。見圖2。

假手術組 模型組 酒石酸布托啡諾組 尼莫地平組

2.4 4組CIRI大鼠腦組織細胞凋亡比較 與假手術組比較，其余3組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組顯著降低(P<0.05)。見圖3,表3。

假手術組 模型組 酒石酸布托啡諾組 尼莫地平組

表3 4組CIRI大鼠腦組織細胞凋亡比較

2.5 4組CIRI大鼠腦組織炎性因子表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 4組CIRI大鼠腦組織炎性因子表達比較

表4 4組CIRI大鼠腦組織炎性因子表達比較

2.6 4組CIRI大鼠腦組織JNK/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中p-JNK/JNK比值、p65、NF-κB蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，酒石酸布托啡諾組和尼莫地平組大鼠腦組織中p-JNK/JNK比值、p65、NF-κB蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 4組CIRI大鼠腦組織JNK/NF-κB信號通路蛋白表達比較

圖5 4組CIRI大鼠腦組織JNK/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較

3 討論

CIRI發生過程中，腦組織能量代謝紊亂、自由基過度形成、炎性反應、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性作用等多種機制相互作用、共同促進，導致神經細胞凋亡，造成神經功能不可逆的缺損，最終導致腦血管疾病患者出現肢體功能殘疾等后遺癥，嚴重降低患者生活質量[11-13]。

酒石酸布托啡諾是一種新型阿片受體激動劑，對κ受體具有高度親和力，對δ受體具有部分激活作用，其通過與這些受體相互作用發揮鎮靜、鎮痛等藥理作用[14,15]。Meng等[16]研究報道，布托啡諾通過靶向NF-κB信號通路減輕膿毒性腦損傷大鼠的炎性反應。提示酒石酸布托啡諾具有一定抗炎、保護腦組織的作用。本研究以尼莫地平為陽性對照，將酒石酸布托啡諾用于CIRI大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠腦組織存在明顯病理形態變化，可見大量炎性細胞浸潤，同時大鼠神經功能評分、腦含水量和腦梗死體積比均明顯增高，表明大鼠腦缺血再灌注后存在明顯的腦組織損傷。經過酒石酸布托啡諾干預后，大鼠腦組織病理形態得到明顯改善，同時大鼠腦含水量和腦梗死體積比均明顯降低。提示酒石酸布托啡諾對腦缺血再灌注損傷具有顯著的改善作用。

研究表明，炎性反應在CIRI的發病機制中起關鍵作用，大量炎性介質如TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子均參與CIRI引起的過度炎性反應，而過度的炎性反應進一步導致腦組織神經細胞凋亡、壞死，炎癥級聯反應和細胞凋亡是腦損傷后神經功能缺損的主要因素[17]。抑制炎性反應對CIRI大鼠具有一定神經保護作用[18]。Shi等[19]報道，抑制腦缺血再灌注大鼠的自噬和凋亡可減輕腦損傷。本研究發現，模型組大鼠腦組織中細胞凋亡率、炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達均明顯升高，酒石酸布托啡諾能夠顯著減輕大鼠腦組織細胞凋亡，降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達。提示酒石酸布托啡諾通過抗凋亡和抗炎作用保護CIRI。

CIRI病理機制復雜，涉及多條信號轉導通路途徑，其中JNK/NF-κB信號通路是近年來研究較多的信號轉導途徑之一。JNK作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的成員之一，被稱為應激激活蛋白激酶。JNK可以被不同的炎性介質激活，它激活后通過磷酸化JNK或其他底物介導多種炎性介質的產生和釋放，促進炎癥發展。NF-κB作為調節炎性反應的核心轉錄因子，JNK可介導NF-κB信號通路的激活，促進活化的NF-κB和p65向細胞核轉移，進一步增加TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子分泌，加重炎性反應和應激反應，進而誘導組織損傷和細胞凋亡[20]。

既往研究表明，JNK抑制劑JNK-IN-8可通過抑制JNK/NF-κB信號通路激活進而抑制缺血性腦卒中的神經炎癥促進功能恢復[21]。最新研究表明，抑制JNK/NF-κB信號傳導，能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的表達[22]。上述結果提示JNK/NF-κB信號通路在缺血性腦血管疾病炎性反應中起著重要作用。本研究結果顯示，模型組大鼠腦組織中p-JNK/JNK比值升高，p-JNK表達量上調，細胞核中NF-κB和p65表達亦上調。這些數據證實CIRI發生過程中JNK/NF-κB信號通路被激活，而酒石酸布托啡諾干預后，能顯著下調大鼠腦組織中p-JNK表達水平，減少核內NF-κB和p65表達。表明酒石酸布托啡諾可能是通過抑制JNK/NF-κB信號通路活化發揮對CIRI的保護作用。

綜上所述，酒石酸布托啡諾能夠有效減輕大鼠CIRI后神經功能缺損、腦水腫和腦梗死，能夠改善大鼠CIRI后腦組織炎性反應和細胞凋亡，其作用機制可能與抑制JNK/NF-κB信號通路活化有關。本研究為CIRI的防治提供了新的可選藥物和潛在靶點，不足之處是未應用信號通路抑制劑進行進一步驗證，后續還需進行實驗研究證實。