TNNT1 在晚期非小細胞肺癌中的表達及與患者預(yù)后的關(guān)系

鄧 浩，朱洪斌，朱 楠，王 瑞

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 巢湖 238000）

肺癌（lung cancer）是近年來世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居首位的惡性腫瘤，而大部分的肺癌患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 是肺癌的主要組織學(xué)類型，包括肺腺癌、肺鱗癌等[1]。近年來肺癌的診治技術(shù)不斷進步，靶向治療及免疫治療在肺癌診治中得到廣泛應(yīng)用，但是NSCLC 的5 年生存率仍然低于20%[2]。這主要是由于肺癌具有極其復(fù)雜的生物學(xué)特性，而且因為缺乏早期診斷，患者在確診時多已處于病程的晚期，尋找有效的治療靶點一直是臨床工作的重點[3]。肌鈣蛋白T1（slow skeletal muscle troponin T，TNNT1）已經(jīng)被報道在宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種癌癥組織中存在過度表達[4]，并且已被證實與腫瘤細胞的增殖和遷移能力等相關(guān)[5]，然而目前還沒有與NSCLC 相關(guān)的研究。本研究首先通過對公共數(shù)據(jù)庫中NSCLC 的數(shù)據(jù)進行挖掘，分析TNNT1mRNA在在NSCLC 中的表達情況及其與預(yù)后的關(guān)系；進一步通過免疫組化方法檢測我院2018 年1 月-2019年9 月收治的80 例晚期NSCLC 患者TNNT1蛋白的表達水平，分析其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，以期為NSCLC 患者的治療和預(yù)后研究提供理論依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 腫瘤基因組計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析 登錄Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）在線分析網(wǎng)站，選擇“TCGA”選項，在檢索框中輸入關(guān)鍵詞“TNNT1”：點擊“expression”得到TNNT1 mRNA 在各種腫瘤中的表達數(shù)據(jù)，切換至“Lung adenocarcinoma”選項導(dǎo)出TNNT1 mRNA 在肺腺癌中的表達情況，切換至“Lung squamous cell carcinoma”選項導(dǎo)出TNNT1mRNA 在肺鱗癌中的表達情況；點擊“survival”進行生存分析，切換至“Lung adenocarcinoma”選項導(dǎo)出TNNT1 表達與肺腺癌患者預(yù)后的生存曲線圖，切換至“Lung squamous cell carcinoma”選項導(dǎo)出TNNT 表達與肺鱗癌患者預(yù)后的生存曲線圖。

1.2 一般資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院2018 年1 月-2019 年9 月收治并經(jīng)病理診斷確診的80 例晚期NSCLC 患者為研究對象，其中鱗狀細胞癌38 例（47.50%），腺癌42 例（52.50%）；男57 例（71.25%），女23 例（28.75%）；年齡53～86 歲；高分化40 例（50.00%），中低分化40 例（50.00%）；Ⅲ期32 例（40.00%），Ⅳ期48 例（60.00%）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22 例（27.50%），轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)者58 例（72.50%）。納入標準：①初次診斷，入院前未經(jīng)放化療，未經(jīng)手術(shù)治療，經(jīng)臨床和病理診斷確診為晚期NSCLC；②臨床資料完整，病理分型分期及隨訪信息完整；③未經(jīng)靶向治療及免疫治療，基因檢測結(jié)果為陰性。排除標準：①繼發(fā)性腫瘤；②數(shù)據(jù)不完全的患者；③失訪患者。本研究所選取的組織均通過病理學(xué)認證，對照組織來源于同期我院心胸外科手術(shù)切除的良性肺部病變組織，共20 例。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測TNNT1 蛋白在肺癌及正常組織表達

1.3.1 免疫組化步驟與方法 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；②煮沸EDTA 抗原修復(fù)液至沸騰，將功率調(diào)至最小進行保溫，將切片置于耐高溫染片架上，放入已沸騰的修復(fù)液中，蓋上鍋蓋，繼續(xù)加熱20 min 后，離開熱源，自然冷卻10 min；自來水沖淋不銹鋼鍋外壁使之冷卻，待鍋中液體冷卻至室溫后取出切片；蒸餾水沖洗及PBS 溶液沖洗；③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：加100 μl 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min；PBS 溶液沖洗；④加一抗：加100 μl 的一抗，室溫下孵育10 min；PBS 溶液沖洗；⑤加酶標聚合物：加100 μl 酶標羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，室溫下孵育15 min；PBS 溶液沖洗；⑥顯色：加100～200 μl新鮮配制的DAB 顯色液，孵育3～5 min，光鏡觀察染色結(jié)果；⑦復(fù)染：自來水沖洗，蘇木素染色液孵育10～30 s；⑧脫水封片。

1.3.2 免疫組化評分 由我院病理科經(jīng)驗豐富的兩位病理診斷醫(yī)師進行雙盲閱片。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以細胞染色強度及陽性細胞的百分比進行評分。出現(xiàn)黃色或棕褐色為陽性染色：無著色為0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分。陽性細胞數(shù)≤10%為1 分，10%～50%為2 分，＞50%為3 分。兩組評分結(jié)果相乘結(jié)果≥3 分即為高表達，＜3 分即為低表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料采用（±s）表示，行t檢驗，采用Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析，Cox 回歸模型進行單因素和多因素分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析TNNT1 mRNA 在NSCLC 中的表達及與預(yù)后的關(guān)系 Ualcan 在線網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集，其中肺腺癌數(shù)據(jù)集包含515 例癌組織和59 例癌旁正常組織，肺鱗癌數(shù)據(jù)集包含503 例癌組織和52 例癌旁正常組織，NSCLC 組織的TNNT1 mRNA 表達水平均較癌旁正常組織水平升高（P＜0.05），見圖1、圖2；進一步利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的臨床資料進行生存分析，結(jié)果顯示在肺腺癌患者中，TNNT1 mRNA 高表達組總生存時間較TNNT1 mRNA 中低表達組的總生存時間短（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖1 TNNT1 在肺腺癌及癌旁組織中的表達水平

圖2 TNNT1 在肺鱗癌及癌旁組織中的表達水平

圖3 TCGA 數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者生存曲線圖

圖4 TCGA 數(shù)據(jù)庫中肺鱗癌患者生存曲線圖

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測TNNT1 蛋白在晚期NSCLC 中的表達情況 TNNT1 蛋白在癌組織中主要呈現(xiàn)高表達，在正常組織中主要呈低表達；在80例晚期NSCLC 組織中，TNNT1 蛋白高表達共54 例（67.50%），低表達為26 例（32.50%）；在20 例正常肺組織中，TNNT1 蛋白高表達共5 例（25.00%），低表達共15 例（75.00%）。TNNT1 蛋白定位于細胞漿，陽性表達呈黃色或棕褐色彌漫染色，見圖5。

圖5 免疫組織化學(xué)染色檢測TNNT1 蛋白在肺腺癌、肺鱗癌和正常組織中的表達情況（×200）

2.3 TNNT1 蛋白的表達水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 TNNT1 蛋白的表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，而與年齡、性別、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤大小無關(guān)，見表1。

表1 TNNT1 表達與晚期NSCLC 患者臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系（n）

2.4 TNNT1 蛋白的表達水平與晚期NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存曲線分析表明，TNNT1蛋白高表達的晚期NSCLC 患者其3 年總生存期及3 年無進展生存期低于TNNT1 蛋白低表達患者；TNNT1 高表達組的mOS 為9.5 個月，mPFS 為4.5 個月；TNNT1 低表達的mOS 為34.5 個月，mPFS 為10.9 個月。TNNT1 蛋白高表達的患者的總生存期及無進展生存期更短，預(yù)后較差，見圖6 和圖7。

圖6 TNNT1 表達與晚期NSCLC 患者OS 的關(guān)系

圖7 TNNT1 表達與晚期NSCLC 患者PFS 的關(guān)系

2.5 Cox 單因素和多因素回歸分析 單因素分析表明，TNNT1 蛋白的表達水平和TNM 分期是影響晚期NSCLC 患者總生存期的重要因素；多因素分析表明，TNNT1 蛋白的表達水平和TNM 分期是晚期NSCLC 患者總生存期的獨立危險因素。單因素分析表明TNNT1 蛋白的表達水平和TNM 分期是影響晚期NSCLC 患者無進展生存期的重要因素；多因素分析同樣表明TNNT1 蛋白的表達水平和TNM 分期是晚期NSCLC 患者無進展生存期的獨立危險因素，見表2。

表2 單因素及多因素分析TNNT1 的表達與晚期NSCLC 患者總生存期和無進展生存期的關(guān)系

表2 （續(xù)）

3 討論

肌鈣蛋白T（Troponin T，TnT）是一種分子量大小為30～35 kDa 的蛋白質(zhì)，其包含220～300 個氨基酸單位，脊椎動物存在3 種類型特異性的同源TnT亞型：TNNT1、TNNT2 和TNNT3[6]。該蛋白家族成員在結(jié)構(gòu)上都具有保守的C 端區(qū)域，但也具有特異的N 端區(qū)域[7]。研究表明[8]，這3 種同源基因在不同的組織區(qū)域中存在差異表達，TNNT1 在慢骨骼肌中表達，TNNT2 在心肌中表達，而TNNT3 在快骨骼肌中表達，TnT 的3 種亞型都通過鈣調(diào)節(jié)機制在肌肉收縮和舒張的生理過程中起重要作用。TNNT1 是包括桿狀體肌病（Nemaline myopathy）在內(nèi)的多種神經(jīng)肌肉疾病的重要致病基因[9]。值得注意的是，近年來TNNT1 在腫瘤發(fā)生中的作用也開始逐漸成為研究的熱點，TNNT1 已被證實在乳腺癌[10]、結(jié)腸癌等多種癌癥組織中存在高表達，并與腫瘤的細胞學(xué)行為以及預(yù)后和生存等相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，TNNT1 mRNA 在肺腺癌和肺鱗癌中存在高表達，而在癌旁組織中低表達（P＜0.05），生存分析結(jié)果顯示，TNNT1 mRNA 高表達組相比于低表達組的總生存時間縮短（P＜0.05），這初步提示TNNT1 可能在NSCLC 的發(fā)生和進展中發(fā)揮作用。免疫組化實驗結(jié)果表明，TNNT1 蛋白在晚期NSCLC 組織中存在高表達，而在正常組織中低表達。TNNT1 的表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，而與年齡、性別、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤大小無關(guān)，說明TNNT1 與晚期NSCLC 的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。生存分析結(jié)果表明，TNNT1 高表達組患者的總生存期和無進展生存期較低表達組短（P＜0.05），預(yù)后較差。有研究[11]通過免疫組化證實TNNT1 在結(jié)腸癌組織中高表達，高表達TNNT1 的結(jié)腸癌患者與低表達組的患者相比，總生存時間縮短，TNNT1 可作為結(jié)腸癌的不良預(yù)后指標。本研究在晚期NSCLC 中也得到了相同的結(jié)果。Cox 單因素和多因素回歸分析結(jié)果表明，TNNT1 的表達水平和TNM 分期是晚期NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），TNNT1 高表達及TNM 分期更晚的NSCLC 患者的預(yù)后較差，總生存期更短，并且更早發(fā)生腫瘤進展，這進一步表明TNNT1 可能在晚期NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

腫瘤細胞的生長是由細胞周期穩(wěn)態(tài)的破壞和維持腫瘤細胞的慢性增殖引起的。在真核細胞中，細胞周期由G1、S、G2、M 期4 個連續(xù)階段組成[12]。TNNT1的過表達可以促進細胞周期蛋白D 和細胞周期蛋白E 的表達，進而增強細胞周期的G1/S 過渡，促進腫瘤細胞的進展，可作為乳腺癌治療的新的靶點[10]。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）在腫瘤發(fā)生中起重要作用，EMT 通過調(diào)節(jié)細胞-細胞粘附、遷移和侵襲能力與癌癥轉(zhuǎn)移相互作用[13]。發(fā)現(xiàn)TNNT1 的過表達可使腫瘤細胞中E-鈣粘蛋白的表達顯著升高，而TNNT1 的表達下調(diào)則會產(chǎn)生相反的作用[14]。TNNT1的缺失和功能獲得證實了TNNT1 可通過調(diào)控EMT相關(guān)因子，包括E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達促進細胞增殖、遷移和侵襲。Gu X 等[15]報道膽囊癌的術(shù)后復(fù)發(fā)與TNNT1 的表達水平相關(guān)，高表達TNNT1的患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率上升，同時TNNT1 的表達水平與血清CA199 的水平存在正相關(guān)，TNNT1 已被確定為該疾病良好預(yù)后的生物標志物。本研究結(jié)果同樣顯示了TNNT1 在晚期NSCLC 中的預(yù)后價值，高表達TNNT1 患者存在不良預(yù)后。研究表明[16，17]，TNNT1可能參與TGF-β 通路的信號調(diào)節(jié)，該通路是腫瘤已被證實是肺癌等多種癌癥進展的關(guān)鍵通路，提示了TNNT1 在肺癌腫瘤機制中的潛在作用。

TCGA 數(shù)據(jù)庫目前廣泛用于癌癥相關(guān)基因的高通量基因組分析，篩選癌癥相關(guān)基因[18]。已有多位學(xué)者的生信研究將TNNT1 篩選為尤因氏肉瘤[19]、胰腺癌[20]等癌癥的預(yù)后相關(guān)基因，本研究前期通過數(shù)據(jù)挖掘篩選出了目標基因TNNT1，發(fā)現(xiàn)TNNT1mRNA在肺癌中存在高表達并與不良預(yù)后相關(guān)。進一步通過免疫組化實驗證實TNNT1 蛋白在晚期NSCLC 組織中存在高表達，高表達組患者的總生存期和無進展生存期較低表達組短，并且與患者的臨床病理參數(shù)特征相關(guān)，COX 回歸分析結(jié)果表明TNNT1 的表達水平和TNM 分期是晚期NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，TNNT1 可能作為NSCLC 治療的新靶點。但研究仍有許多不足，納入研究的樣本量較小，并且仍局限在mRNA 和蛋白水平對TNNT1 在NSCLC 中的臨床價值進行探討，TNNT1 在NSCLC中的具作用機制研究仍有待基礎(chǔ)實驗證實。