類器官在呼吸系統研究中的應用

鄭紅瑩，胡曉波

（1.成都中醫藥大學醫學與生命科學學院，四川 成都 610000；2.成都市中西醫結合醫院/成都市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，四川 成都 610000）

肺（lung）是溝通人體內部與外界環境的器官，在各種外界因素（如煙霧、粉塵、細菌和病毒等）的長期暴露下，肺部疾病呈現出多樣性和復雜性。疾病模型的相對不足是制約研究肺部疾病發生機制及藥物治療的最重要因素。類器官（organoids）是三維細胞培養技術的一種，它能模擬體內環境，構建出與體內器官有著相似形態學與細胞生物學特性的模型[1]。相比于價格昂貴且存在物種特異性差異的動物模型，類器官具有經濟效益更高、耗時更短和遺傳更穩定等優點[2]。作為一種新的體外模型，類器官可用于研究人體器官發育、疾病建模、藥物篩選等多個方面。本文就類器官的培養、肺類器官的主要類型以及類器官在肺部感染性疾病、肺癌、慢性炎癥性肺病、間質性肺病中的應用現狀作一綜述，以期為探索肺部疾病的發生機制及其治療提供參考。

1 類器官的培養

類器官是干細胞在體外通過三維組織構建并定向分化為靶器官，形成與體內器官有著相似空間結構、分布的三維細胞復合體。干細胞的主要類型是多能干細胞和成人干細胞，細胞的來源可以是標準細胞系，或者是穿刺或手術切除的組織經過酶解得到的單細胞，以及癌癥患者血液或轉移性胸水中得到的癌細胞[3，4]。而細胞三維結構的建立則包括了細胞嵌入基質支架生長、細胞在重力與表面張力作用下通過固定培養基的液滴培養和細胞通過空氣-液體界面在空氣中極化與分化等方式[5]。類器官的生長還需要三維基質與細胞因子。三維基質是模擬體內微環境，并為細胞生長提供附著點和營養的關鍵物質。常見的三維培養基質是支架，類型包括基質膠、多孔膜特殊培養小室、水凝膠等[6]。實現類器官的長期體外培養，需要在基礎培養基中添加相應物質，如促進增殖的表皮生長因子（EGF）、促進增殖分化的成纖維細胞生長因子等細胞因子以及皮質醇激素、抗生素等[7]。通過以上方式，研究人員已成功構建了腦[8]、心臟[9]、腸[10]、肝[11]、腎[12]、肺[13]等多個部位的類器官模型。

2 肺類器官

肺類器官是指細胞分化后產生的與人體肺有著類似形態和功能的三維細胞簇。目前主要將肺類器官分為2 種，分別是由正常細胞培養形成的氣道類器官和由腫瘤細胞培養的肺癌類器官。

2.1 氣道類器官 氣道類器官是氣道上皮細胞或肺泡上皮細胞構成的有著氣管或肺泡樣形態的三維模型。肺干細胞（基底細胞、肺泡細胞和氣道分泌細胞）或多能干細胞是其主要來源。將支氣管基底細胞在空氣-液體界面培養，最終分化成為外層是基底細胞、內層是纖毛細胞的支氣管球三維結構[14-16]。肺祖細胞與間充質細胞共培養時，肺祖細胞可在間充質細胞影響下向氣道和肺泡結構分化[17，18]。將支氣管上皮細胞、肺成纖維細胞和肺微血管內皮細胞在支持性3D 培養條件下共同培養，混合細胞群會快速凝結和組織，形成離散的上皮和內皮結構，產生多細胞管狀氣道類器官[19]。氣道類器官具有人體呼吸系統的基礎結構，在呼吸系統疾病建模、氣道功能探索等方面已經有了相應的運用和探索，未來有望在肺部疾病的研究中取得進一步的成果。

2.2 肺癌類器官 肺癌類器官由腫瘤細胞培養形成，目前腺癌、鱗癌、腺鱗癌、小細胞癌和大細胞癌等各型肺癌類器官均能成功培養。這些肺癌類器官模型均表現出了對應類型的組織學和遺傳學特征，部分模型更表達了其特異的生物標志物。如肺腺癌類器官能查看到腺泡、乳頭等肺腺癌的病理特征，并表達其標志物napsin-A、甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）和細胞角蛋白7（CK-7）等[18，19]。肺鱗癌類器官顯示了明顯的細胞邊界和細胞角化等鱗癌組織學特征以及特異性標記物p63 和CK5/6。肺腺鱗癌類器官則保留了腺癌和鱗狀細胞癌的混合組織學特征。大細胞肺癌類器官顯現了CK734 和CD133 的表達。小細胞肺癌類器官有神經內分泌特征和CD56、TTF-1 等標志物的表達[20]。總之，肺癌類器官擁有原發腫瘤的病理特征和基因譜，已應用于肺癌的發生機制、藥物篩選以及精準治療等多方面研究。

3 類器官在肺部疾病的應用

3.1 感染性肺病 呼吸道感染是造成肺部疾病的主要原因，感染因素包括細菌、病毒、支原體和衣原體等。研究人員已經開始運用類器官技術對病毒感染導致的肺炎進行研究。新型冠狀病毒作為全球的公共衛生事件，會引起一系列呼吸系統癥狀，嚴重者可能危及生命[21]。肺類器官作為呼吸系統的研究模型，在新型冠狀病毒的研究中發揮了作用。Katsura H等[22]通過研究感染了新型冠狀病毒的肺類器官，發現新型冠狀病毒會抑制肺泡Ⅱ型細胞表面活性劑的表達，初步探討了新型冠狀病毒在肺部的感染機制。Ebisudani T 等[23]通過新型冠狀病毒感染模型，發現了洛匹那韋和瑞德西韋對新型冠狀病毒的抗病毒作用。呼吸道合胞病毒（RSV）感染導致的肺炎是兒童住院和死亡的主要原因。Sachs N 等[24]在評估氣道類器官用作RSV 體外感染模型時發現，感染了RSV的氣道類器官出現了氣道上皮的重塑和IP-10、RANTES 等細胞因子的大量分泌，提示RSV 感染的發生機制。Harford TJ 等[25]在研究產前RSV 感染對胎兒肺部結構和功能的作用時發現，感染了RSV的氣道類器官出現了克氏細胞標志物CC10 和TRPV1 鈣通道的表達增加，纖毛細胞標志物FoxJ1的表達降低以及E-鈣粘蛋白結構的破壞，提示了RSV 可能的感染機制。類器官技術不僅被應用于肺部的病毒感染性疾病，在人體其他器官的病毒感染性研究中也發揮了作用，如腸道類器官被用于研究輪狀病毒感染導致的腹瀉等[26]。類器官技術在病毒感染性疾病研究中擁有的獨特優勢，有望在呼吸、消化、循環和泌尿等多個系統的病毒感染性疾病中發揮作用。

3.2 肺癌 肺癌類器官已應用于肺癌的發病機制、藥物篩選和基因靶向精準治療等多個方面。Nakamura H等[27]在肺腺癌細胞與腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）共培養形成的肺癌類器官模型中發現平足蛋白（Podoplanin）陽性的CAFs 可以調高肺腺癌細胞的增殖，推測Podoplanin 可能參與了肺腺癌的發病過程。Li YF 等[28]利用肺癌類器官生物庫，對氯化白屈菜紅堿、三尖杉酯堿、斑蝥素和小檗堿等多種天然化合物的抗腫瘤療效進行了初步研究。Kim M 等[18]研究發現，奧拉帕尼抑制了乳腺癌2 號基因（BRCA2）突變的肺癌類器官的生長，厄洛替尼則抑制了表皮生長因子受體（EGFR）突變的肺癌類器官的生長。Wang Y 等[29]研究發現，吡咯替尼對人類表皮生長因子受體2（HER2）外顯子20 突變的肺癌類器官有明顯的抗腫瘤活性，并通過臨床試驗得到驗證。雖然肺癌類器官已被廣泛應用于肺癌的多項基礎研究，但肺癌的發病與治療相對復雜，單純的肺癌類器官技術可能有一定的局限性。未來，伴隨著其他新興生物學技術（如基因編輯等）與肺癌類器官技術的結合，肺癌的研究可能會取得更多的成果。

3.3 慢性炎癥性肺病 慢性炎癥性肺病包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）。類器官技術已被應用于上皮細胞修復、細胞增殖分化和肺氣腫等與哮喘、COPD 發病過程有關的研究中。Wu X 等[30]在研究WNT-5A 和WNT-5B 對肺泡上皮祖細胞的作用時發現，兩者均可抑制WNT/β-catenin 信號和肺上皮細胞培養生成的類器官數量，提示上皮細胞修復過程可能有非經典WNT 信號通路的參與。Wang A 等[31]在研究Gabrp（γ-氨基丁酸受體）對克氏細胞增殖分化的作用時發現，應用Gabrp 抑制劑后，小鼠克氏細胞增殖分化為杯狀細胞的能力以及生成的類器官數量均被抑制，推測克氏細胞增殖分化過程中可能有GABA/Gabrp 信號通路的參與。Pouwels SD 等[32]在肺氣腫發病機制的研究中發現，在細胞培養過程中用RAGE配體LL-37 或HMGB1 處理后，上皮細胞與成纖維細胞生成的類器官數量明顯減少，但平均直徑增加，提示RAGE 通路可能與肺氣腫的發生有關。哮喘和COPD 的發病機制復雜，不能用單一的信號通路來解釋其過程，未來還需要進行更多更深入的研究。

3.4 間質性肺病 間質性肺病是一組彌漫性實質性肺疾病，最終發展為肺纖維化和呼吸衰竭。類器官雖然已經應用于間質性肺病的研究，但目前主要處于疾病模型和相關信號通路的探索階段。Mccauley KB 等[33]在研究氣道類器官生成時發現，調節經典Wnt 信號通路可以使人類誘導多能干細胞（iPSC）定向分化為功能性氣道類器官，并通過這種方式，建立了囊性纖維化患者特異性iPSC 衍生的有腫脹缺陷的氣道類器官。Tan Q 等[17]使用人氣道類器官模擬纖維化刺激反應時發現，TGF-β1 能抑制氣道類器官的管狀物對周圍基質的侵襲，并且增加纖維化基因的表達。Chen YW 等[34]在建立氣道類器官時發現，HPS1 與細胞纖維化存在相關性，推測HPS1 信號通路可能參與了肺纖維化過程。

4 總結與展望

類器官作為新興的三維細胞培養技術，受到臨床廣泛關注。目前，國外已有大量類器官研究成果，國內部分實驗室也開始了類器官的初步探索。類器官技術雖然在不斷發展，但仍存在部分缺陷：①缺乏標準化的培養體系，同時培養方式根據目標和細胞的不同而不斷變化；②相比于體內實驗，類器官模型較為簡單，無法完全再現體內微環境，且缺乏神經、血管等物質；③類器官的構建難度大，如培養生成的類器官數量少，肉眼無法進行準確觀察。但即使類器官存在以上缺陷，類器官模型仍被廣泛應用于發病機制、藥物篩選、基因和靶向治療等基礎研究。同時，類器官技術也開始了與其他新興生物工程技術相結合。總之，作為新穎的生物學技術，類器官在多種疾病的研究中（特別是病毒感染性疾病）已經展現了不可替代的優勢，未來隨著與其他新興生物工程技術的結合，類器官可能會發揮出更大的應用價值。