蒲公英水提物對臨床常見腸道有害菌體外抑菌作用的研究

張維華，王 翠，竇建衛(wèi)，吳曉康

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；2.陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 西安 710068；3.陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710068；4.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710004）

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz）屬為菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國各省區(qū)。蒲公英是藥食兩用的植物，具有抗菌、保肝利膽、免疫促進(jìn)、抗內(nèi)毒素及抗胃損傷等作用。蒲公英中含有多種生物活性成分，主要包括黃酮類、萜類、生物堿類、香豆素、芪類、酯類、甾醇類等，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗菌消炎、抗氧化等生物活性[1]，臨床上主要用于治療癤癰、痤瘡、急性結(jié)膜炎、急性扁桃體炎、急性乳腺炎、急性支氣管炎、急慢性闌尾炎、鼻炎、咽炎、胃炎、消化性潰瘍、膽囊炎、膽石癥、肝炎、泌尿系統(tǒng)感染、陰道炎、盆腔炎、骨髓炎、流行性腮腺炎以及癌癥等多種疾病[2，3]，特別是近年來報(bào)道其對乳腺癌具有顯著的抗癌活性[4-6]。腸道菌群是人體內(nèi)最為復(fù)雜，且數(shù)量最高的共生微生物生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群的代謝作用相當(dāng)復(fù)雜，與人體的健康和疾病密切相關(guān)。正常情況下，人體腸道菌群按一定的比例組合，各菌種之間互相依存并互相制約。在種類和數(shù)量上存在一定的動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，便會(huì)造成腸道菌群失調(diào)。近年多項(xiàng)研究表明[7，8]，腸道菌群失調(diào)，尤其是腸道有害菌的數(shù)量及占比的增高，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。臨床常見的腸道有害菌包括擬桿菌屬、梭菌屬、芽孢桿菌屬等。本試驗(yàn)主要探究蒲公英對從糞便標(biāo)本分離臨床常見腸道有害菌的體外抑菌作用，旨在為臨床預(yù)防和治療菌群失調(diào)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蒲公英水提物 稱取中草藥蒲公英200 g，以8倍量水浸泡40 min 后煮沸，小火煎煮1.5 h，傾出藥液，經(jīng)8 層紗布過濾。再向蒲公英中加入6 倍量水，煮沸后小火煎煮1 h，傾出藥液，經(jīng)8 層紗布過濾。將兩次藥液混合后置于冰箱，4 ℃沉淀過夜。次日取上清煮沸，小火濃縮藥液至100 ml，將上清轉(zhuǎn)移至無菌杯。-20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)中每毫升蒲公英藥液相當(dāng)于2 g 蒲公英原藥材，即蒲公英藥液濃度為2 g/ml。

1.2 菌株

1.2.1 標(biāo)本選取 臨床送檢的糞便標(biāo)本中選取性狀異常的標(biāo)本，分離得到菌株，且每位患者體內(nèi)同一種菌株只采集1 株，重復(fù)者不予計(jì)算。

1.2.2 接種培養(yǎng) 臨床送檢糞便標(biāo)本，挑取性狀異常部位接種于2 個(gè)血瓊脂平皿，分別置于空氣和厭氧環(huán)境，次日觀察細(xì)菌生長情況。

1.2.3 鑒定分離 采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF）對分離出的菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.4 菌株選取 選取產(chǎn)氣莢膜梭菌5 株，脆弱擬桿菌5 株，蠟樣芽胞桿菌5 株。

1.3 培養(yǎng)基 每3 g TRYPTONE SOYA BROTH（TSB）（OXOID）瓊脂粉加入100 ml 純水，混勻加塞，放入高壓鍋121 ℃，0.11 MPa 高壓滅菌30 min。

1.4 肌紅蛋白 50 ng/ml 肌紅蛋白（BECKMAN COULTER）作為參照蛋白。

1.5 萃取及檢測試劑 甲酸（ThermoFisher Scientific）、乙腈（SIGMA-ALORICH）、乙醇（LiChrosolv）、HCCA基質(zhì)液（Bruker）、純水、三氟乙酸（SIGMAALORICH）。

1.6 儀器設(shè)備 35 ℃培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有現(xiàn)公司醫(yī)療設(shè)備廠，SPX-250B-Z）、比濁儀（BD，Phoenix Spec）、移液器（Thermo Scientific，F(xiàn)INNPIPETTE F3）、離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，H1650-W）、渦旋儀（上海舍巖儀器有限公司，VMD）、厭氧發(fā)生袋（MITSUBISHI GAS CHEMICAL CO.,INC，0102MJ-1）、基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Bruker，MALDIBIOTYPER）。

1.7 菌液配制 配制0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海簼舛燃s為1×108CFU/ml。

1.8 蒲公英不同濃度藥液配制 無菌操作條件下，取7 支10 ml 無菌試管并編號。所有試管中分別加入2 ml 已滅菌的TBS 培養(yǎng)基，第1 管加入濃度為2 g/ml蒲公英藥液2 ml，充分混勻后取出2 ml 藥液稀釋液加入第2 管。重復(fù)上述操作稀釋至第6 管，第6 管需取出2 ml 棄去。第7 管未加蒲公英作為生長陽性對照。配制蒲公英藥液濃度依次為：1.0、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0 g/ml。

1.9 最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定 采用二倍稀釋法，分別測定蒲公英對腸桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.9.1 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)細(xì)菌 取0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?0 μl，分別加入含不同濃度蒲公英藥液試管。另取1 支試管，僅加入2 ml TBS 培養(yǎng)基，作為陰性對照。將產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌置于厭氧環(huán)境，蠟樣芽胞桿菌置于空氣環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.9.2 檢測干預(yù)后細(xì)菌生長情況 將培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液混勻，取10 μl 采用連續(xù)劃線方法接種于血瓊脂平皿。同樣將產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌置于厭氧環(huán)境，蠟樣芽胞桿菌置于空氣環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察血瓊脂平皿細(xì)菌生長情況并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.9.3 判斷結(jié)果 MIC 為可抑制某種細(xì)菌生長、繁殖的最低藥液濃度。與陽性生長對照組比較，抑制80%細(xì)菌生長的最低藥液濃度即為受試菌MIC[9]。MBC 為殺死某種菌株的藥物最低藥液濃度。與陽性生長對照組比較，殺死99.9%（降低3 個(gè)數(shù)量級）活菌的最低藥液濃度即為受試菌MBC[9]。

1.10 細(xì)菌蛋白表達(dá)的變化 通過MALDI-TOF 質(zhì)譜儀檢測干預(yù)后細(xì)菌蛋白表達(dá)種類及含量。

1.10.1 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)細(xì)菌 根據(jù)細(xì)菌生長情況選擇不同濃度蒲公英藥液干預(yù)細(xì)菌：產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇0、0.03、0.06、0.125 g/ml；脆弱擬桿菌選擇0、0.03、0.06 g/ml；蠟樣芽胞桿菌選擇0、0.03、0.06、0.125、0.25 g/ml。向含不同濃度蒲公英藥液試管中分別加入0.5 麥?zhǔn)蠞舛染?0 μl。另取1 支試管加入TBS 培養(yǎng)基2 ml 作為陰性對照，將產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌置于厭氧環(huán)境，蠟樣芽胞桿菌置于空氣環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h。

1.10.2 甲酸萃取法提取細(xì)菌樣本 取1 ml 培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液，13 000 rpm 離心2 min，棄去上清，加入1 ml 生理鹽水，渦旋混勻1 min 后離心2 min，棄去上清。沉淀中加入300 μl 超純水，渦旋混勻1 min，加入900 μl 無水乙醇，渦旋混勻1 min，13 000 rpm離心2 min，棄去上清，沉淀中加入50 μl 70%甲酸水溶液，反復(fù)吹打并渦旋實(shí)現(xiàn)徹底混合，加入50 μl乙腈，吹打混勻，13 000 rpm 離心2 min，將1 μl 細(xì)菌萃取物上清液移取至MALDI 靶板上，同時(shí)用牙簽沾取少量肌紅蛋白涂抹至同一位置，與上清液混勻，待干后取1 μl 基質(zhì)溶液涂敷在每個(gè)樣本上，待干后將靶板插入MALDI-TOF 質(zhì)譜儀。

1.10.3 質(zhì)譜儀基質(zhì)液配置 選擇α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）作為質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)，用V（超純水）∶V（乙腈）∶V（三氟乙酸）=19∶20∶1 的比例配置溶劑。向含有2.5 mg HCCA 基質(zhì)干粉中加入250 μl 溶劑，配成濃度為10 g/L 的基質(zhì)溶液，溶解后的基質(zhì)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.10.4 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀狀態(tài) 離子解析電離源脈沖激光為337 nm，離子加速電壓19.98 kV，質(zhì)譜掃描范圍m/z 1960～20 137，飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的工作壓力＜5×10-8mbar，采用正離子線性模式，質(zhì)譜信號為多次累加掃描。

1.10.5 檢測干預(yù)后細(xì)菌蛋白表達(dá)情況 采用Flex－Control 2.0 軟件檢測樣品，每個(gè)樣本經(jīng)過質(zhì)譜儀激光打靶檢測后生成圖譜。圖譜中橫坐標(biāo)為質(zhì)核比（m/z），縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度（Intens.）。應(yīng)用FlexAnalysis 3.0軟件分析圖譜及參數(shù)。

1.10.6 判斷結(jié)果 MALDI-TOF 質(zhì)譜圖譜橫坐標(biāo)m/z可以反應(yīng)蛋白分子量，離子m/z 個(gè)數(shù)或峰數(shù)量可體現(xiàn)蛋白種類的豐富程度。細(xì)菌峰強(qiáng)度與內(nèi)參蛋白峰強(qiáng)度比值為相對峰值，相對峰值可反應(yīng)相應(yīng)蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英對3 種細(xì)菌生長的抑制作用 計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中所含菌量公式為：菌量（CFU/ml）=血瓊脂平皿菌落數(shù)×100，計(jì)算結(jié)果見表1，產(chǎn)氣莢膜梭菌在蒲公英藥液0.06 g/ml 時(shí)生長明顯抑制，在0.25 g/ml時(shí)無細(xì)菌生長；脆弱擬桿菌在蒲公英藥液濃度0.03 g/ml 時(shí)生長明顯抑制，在0.125 g/ml 時(shí)無細(xì)菌生長；蠟樣芽胞桿菌在蒲公英藥液濃度0.125 g/ml時(shí)生長明顯抑制，在0.5 g/ml 時(shí)無細(xì)菌生長。將不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后的細(xì)菌生長與不含蒲公英藥液對照組相比較，得到3 種細(xì)菌分別的MIC 及MBC值，見表2，結(jié)果顯示中藥蒲公英的水提物對產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌、蠟樣芽胞桿菌均有很好體外抑菌作用。

表1 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后每毫升培養(yǎng)液中所含菌量（CFU/ml）

表2 蒲公英藥液對3 種細(xì)菌的MIC 及MBC（g/ml）

2.2 蒲公英干預(yù)對3 種細(xì)菌蛋白種類的影響

2.2.1 干預(yù)后3 種細(xì)菌質(zhì)譜圖譜中的峰數(shù)量明顯減少 使用肌紅蛋白作為參照蛋白，其m/z 處于3513～3515 位置，用于規(guī)避實(shí)驗(yàn)操作及檢測失誤。隨著蒲公英藥液濃度的升高，干預(yù)后3 種細(xì)菌質(zhì)譜圖譜中的峰數(shù)量明顯減少。產(chǎn)氣莢膜梭菌：蒲公英藥物濃度為0 g/ml 時(shí)顯著峰有6 個(gè)，離子m/z 為3884、4791、5277、6722、6992、7677；藥物濃度為0.03 g/ml時(shí)顯著峰有5 個(gè)，離子m/z 為3884、4792、5279、6296、6724；藥物濃度為0.06 g/ml 時(shí)顯著峰有3 個(gè)，離子m/z 為3882、6376、7198；藥物濃度為0.125 g/ml時(shí)顯著峰僅有1 個(gè)，離子m/z 為：3884。脆弱擬桿菌：蒲公英藥物濃度為0 g/ml 時(shí)顯著峰有5 個(gè)，離子m/z為3885、4684、6520、7397、9363；藥物濃度為0.03 g/ml時(shí)顯著峰有2 個(gè)，離子m/z 為3885、5252；藥物濃度為0.06 g/ml 時(shí)顯著峰僅有1 個(gè)，離子m/z 為3885。蠟樣芽胞桿菌：蒲公英藥物濃度為0 g/ml 時(shí)顯著峰有8 個(gè)，離子m/z 為3679、4602、5166、5611、6255、7359、7761、9202；藥物濃度為0.03 g/ml 時(shí)顯著峰有8 個(gè)，離 子m/z 為3679、4329、5165、5879、6418、7357、7759、9199；藥物濃度為0.06 g/ml 時(shí)顯著峰有5 個(gè)，離子m/z 為3882、4601、5166、6255、7306；藥物濃度為0.125 g/ml 時(shí)顯著峰僅有1 個(gè)，離子m/z 為3883；藥物濃度為0.25 g/ml 時(shí)顯著峰僅有1 個(gè)，離子m/z 為3883，見圖1～3。

圖1 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后產(chǎn)氣莢膜梭菌質(zhì)譜圖譜

圖2 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后脆弱擬桿菌質(zhì)譜圖譜

圖3 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后蠟樣芽孢桿菌質(zhì)譜圖譜

2.2.2 干預(yù)后3 種細(xì)菌的離子m/z 數(shù)量明顯減少 產(chǎn)氣莢膜梭菌：蒲公英藥物濃度為0、0.03、0.06、0.125 g/ml 時(shí)，離子m/z 種類分別有35、8、6、6 種；脆弱擬桿菌：蒲公英藥物濃度為0、g/ml、0.06 g/ml時(shí)離子m/z 數(shù)量種類分別有76、47、44 種；蠟樣芽胞桿菌：蒲公英藥物濃度為0、0.03、0.06、0.125、0.25 g/ml 時(shí)離子m/z 種類分別有40、42、32、7、5 種。質(zhì)譜參數(shù)顯示離子m/z 種類明顯減少，見表3，表明中藥蒲公英的水提物可顯著減少產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌、蠟樣芽胞桿菌的蛋白種類。

表3 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后3 種細(xì)菌離子m/z 數(shù)量的變化

2.3 蒲公英干預(yù)后3 種細(xì)菌的主要蛋白含量顯著降低 通過質(zhì)譜參數(shù)選擇峰強(qiáng)度較高的前10 種離子m/z，參照蛋白m/z 為3513～3515，記錄不同離子m/z 對應(yīng)的峰強(qiáng)度，計(jì)算其相對峰值，計(jì)算公式為：相對峰值=細(xì)菌峰強(qiáng)度/參照蛋白峰強(qiáng)度。選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌峰強(qiáng)度較高的離子m/z 為：6992.75、6961.14、6722.71、5294.07、5277.99、4791.11、3884.37、3551.63、3535.95、3496.39。脆弱擬桿菌峰強(qiáng)度較高的離子m/z 為：9363.11、7397.23、6584.93、6566.31、6540.30、6520.04、6492.50、4684.01、3885.27、3259.65。蠟樣芽孢桿菌峰強(qiáng)度較高的離子m/z 為：7359.65、6255.05、5210.66、5183.15、5166.96、5150.56、4602.03、3679.26、2581.32、6420.36。結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌、蠟樣芽胞桿菌分別在蒲公英濃度為0.03、0.06、0.125 g/ml 時(shí)離子相對峰值明顯降低且成劑量依賴性，意味著中藥蒲公英的水提物可減少產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌、蠟樣芽胞桿菌的蛋白含量，見圖4～圖6。

圖4 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后產(chǎn)氣莢膜梭菌相對峰值

圖5 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后脆弱擬桿菌相對峰值

圖6 不同濃度蒲公英藥液干預(yù)后蠟樣芽胞桿菌相對峰值

3 討論

對抗菌藥物抑菌效果的檢測，傳統(tǒng)的方法多基于生長實(shí)驗(yàn)等方法，這些傳統(tǒng)方法往往耗時(shí)長且靈敏度低[10]。本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步深入探究蒲公英對細(xì)菌的影響，使用傳統(tǒng)方法聯(lián)合MALDI-TOF 質(zhì)譜儀檢測細(xì)菌中蛋白的表達(dá)情況。近年來發(fā)展起來的基于質(zhì)譜的檢測方法具有快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[11]，MALDI-TOF 質(zhì)譜儀質(zhì)譜檢測細(xì)菌主要基于分析細(xì)菌解離后離子質(zhì)核比，可間接反映細(xì)菌蛋白種類及含量。本實(shí)驗(yàn)中為了能夠比較蛋白的含量的變化，引入了肌紅蛋白作為參照蛋白[12]。質(zhì)譜圖譜中可以看到，未經(jīng)處理的細(xì)菌質(zhì)譜圖譜有較為豐富的峰，而經(jīng)高濃度蒲公英藥液干預(yù)后圖譜中僅包含參照蛋白的峰，參照蛋白一方面可以較好的反映質(zhì)譜檢測效果，另一方面可于計(jì)算相對峰值，反映真實(shí)峰強(qiáng)度變化，體現(xiàn)細(xì)菌中蛋白的相對含量。

產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌、蠟樣芽胞桿菌為腸道中具有代表性的有害菌，本研究中采用不同濃度蒲公英藥液對3 種細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，從細(xì)菌的生長、細(xì)菌蛋白種類、細(xì)菌蛋白含量3 方面驗(yàn)證了蒲公英對腸道有害菌的作用。研究結(jié)果顯示，蒲公英藥液對其有很強(qiáng)的抑菌及殺菌作用，并確定了蒲公英藥液對不同細(xì)菌的抑菌和殺菌濃度，其對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 為0.06 g/ml，MBC 為0.25 g/ml；對脆弱擬桿菌的MIC 為0.03 g/ml，MBC 為0.125 g/ml；對蠟樣芽胞桿菌的MIC 為0.125 g/ml，MBC 為0.5 g/ml。隨著蒲公英藥液濃度的增加，3 種細(xì)菌的蛋白種類明顯減少，當(dāng)蒲公英藥液濃度由0 g/ml 增加至0.125 g/ml 時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的蛋白種類由6 種減少到1 種，當(dāng)蒲公英藥液濃度由0 g/ml 增加到0.06 g/ml 時(shí)，脆弱擬桿菌的蛋白種類由5 種減少到1 種，當(dāng)蒲公英藥液濃度由0 g/ml 增加到0.25 g/ml時(shí)，蠟樣芽胞桿菌的蛋白種類由8 種減少到1 種，同時(shí)3 種細(xì)菌的蛋白含量明顯降低且成劑量依賴性，從多個(gè)方面證實(shí)了蒲公英對于腸道有害菌的抑制和殺傷作用，為臨床使用蒲公英預(yù)防和治療菌群失調(diào)提供了參考依據(jù)。質(zhì)譜較好的反映了細(xì)菌整體蛋白種類及表達(dá)量情況，但圖譜中細(xì)菌具體為是哪種蛋白發(fā)生了改變尚不清楚，后期將在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討蒲公英所影響的這些蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白還是功能蛋白，闡明其具體的抑菌機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英對腸道有害菌具有抑制作用，也有文獻(xiàn)提出蒲公英多糖可以調(diào)節(jié)正常菌群和益生菌數(shù)量，從而改善腸道菌群失調(diào)[13]。腸道菌群為疾病和健康的重要調(diào)控因素，正常腸道菌群具有消化、吸收、代謝等生理功能，并參與免疫反應(yīng)，可保證人體的正常生理功能，此外，腸道菌群在一些腫瘤治療過程中也有關(guān)鍵作用[14，15]。但近年來隨著抗菌藥物的使用，臨床患者出現(xiàn)菌群失調(diào)的比例大大增加。研究表明，腸道菌群失調(diào)后，尤其是腸道中有害菌的數(shù)量及占比增高，會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)、促發(fā)炎癥、影響免疫功能和激素水平等，從而引起肥胖、糖尿病、腫瘤等疾病[16-19]。

蒲公英作為臨床常用中藥，對各種炎癥、濕熱性便秘、產(chǎn)婦缺乳、肝火旺盛、高脂血癥、甲狀腺功能亢進(jìn)等多種疾病均有顯著的臨床療效[20-22]。此外，蒲公英對乳癰具有獨(dú)特的治療作用，有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)了近30 年來，41 位名老中醫(yī)治療乳腺癌的用藥特色，發(fā)現(xiàn)蒲公英單藥常用于乳腺癌治療[23]。那么蒲公英如此多的臨床功效是否與其調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)，這將為現(xiàn)代中藥的藥物機(jī)制研究提供更多新的研究思路。

綜上所述，草藥蒲公英的水提物對臨床常見的腸道有害菌的生長及蛋白合成具有很好的抑制作用。