基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討淫羊藿苷治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制

周奕良，毛國慶

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種由多種原因引起的以骨量減少、骨強(qiáng)度降低及易發(fā)生脆性骨折等為特征的全身性骨骼疾病[1]。據(jù)估計(jì)[2]，大于50 歲的一半女性和20%的男性會在余生出現(xiàn)骨折風(fēng)險(xiǎn)。骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致全身關(guān)節(jié)持續(xù)疼痛，日常生活困難，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。在本病的發(fā)展過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的失衡是其發(fā)生的重要原因之一，性激素、炎癥反應(yīng)等多種因素也參與其中[3]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物以骨吸收抑制劑為主，加少量的骨形成促進(jìn)劑，但這些藥物也有著許多的副作用[4，5]。因此，制定新的策略來預(yù)防該種疾病至關(guān)重要。淫羊藿又名仙靈脾，是一種臨床常見的中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味辛甘，歸肝腎經(jīng)。現(xiàn)代中藥藥理學(xué)表明[6]，淫羊藿具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效。淫羊藿主要含有淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷和淫羊藿多糖等生物活性成分，在免疫系統(tǒng)、骨代謝方面具有良好的臨床應(yīng)用[7]。淫羊藿苷是其中主要活性單體之一，其對骨代謝、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤、炎癥等均具有作用[8]，但關(guān)于淫羊藿苷的分子作用機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于疾病-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的新興學(xué)科，基于網(wǎng)絡(luò)相互作用研究中藥的生物學(xué)知識，在生物分子水平上闡明中藥有效成分的藥理作用機(jī)制。本研究構(gòu)建了淫羊藿苷的網(wǎng)絡(luò)藥理模型，系統(tǒng)分析淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制，并進(jìn)行分子對接，預(yù)測結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿苷相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 淫羊藿苷的所有靶點(diǎn)通過以下4 個(gè)數(shù)據(jù)庫收集：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp -e.com/molecule.php?qn=1164）[9]、毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD，http://ctdbase.org)[10]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）[11，12]、STITCH 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de）[13]。選擇智人相關(guān)基因，剔除重復(fù)基因。

1.2 骨質(zhì)疏松相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選 以“骨質(zhì)疏松”為搜索關(guān)鍵詞，搜索OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫，挖掘與骨質(zhì)疏松相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。訪問DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com）[14]，查找已批準(zhǔn)的骨質(zhì)疏松干預(yù)藥物靶點(diǎn)。將3 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫靶標(biāo)組合，刪除重復(fù)值，得到與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)。

1.3 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用RStudio 軟件，獲得淫羊藿苷靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)的交點(diǎn)，繪制Veen 圖。提取交集靶點(diǎn)，提交STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）[15]，構(gòu)建潛在作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。類型設(shè)置為“智人”，最小交互閾值設(shè)置為“最高置信度”（＞0.9），其余設(shè)置為默認(rèn)值。最后，將PPI 結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 中心基因分析 利用MCC 算法在Cytoscape 的Cytohubba 插件中計(jì)算淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松的PPI基因，得到相關(guān)蛋白靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。最后，展示前10名的核心目標(biāo)。

1.5 GO 富集和KEGG 富集 為了明確與淫羊藿苷相互作用的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號通路中的作用，本研究利用R 軟件對淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。保存數(shù)據(jù)結(jié)果，使用R 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對接 將骨質(zhì)疏松的10 個(gè)潛在靶蛋白與淫羊藿苷進(jìn)行分子對接。目標(biāo)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫下載。然后將目標(biāo)蛋白導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6 中進(jìn)行氫化、電荷計(jì)算，然后將結(jié)果以PDBQT 格式存儲。最后，使用AutoDock 用于分子對接，保留其結(jié)合能＜-5 kcal/mol 并使用PyMOL 可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷的靶點(diǎn)獲得 通過搜索TCMSP、CTD、GeneCards、STITCH，共得到相關(guān)靶點(diǎn)148 個(gè)。

2.2 骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)獲得 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，限定Score 值＞5 篩選后得到375 個(gè)靶點(diǎn)。在搜索OMIM 數(shù)據(jù)庫后，發(fā)現(xiàn)了605 個(gè)相關(guān)基因。DrugBank數(shù)據(jù)庫的搜索進(jìn)行了補(bǔ)充，獲得了22 個(gè)靶點(diǎn)。將結(jié)果合并剔除重復(fù)基因，得到898 個(gè)骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 Veen 圖和PPI 圖構(gòu)建 取淫羊藿苷與骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)的交點(diǎn)，用R 軟件繪制Veen 圖（圖1），得到50 個(gè)交點(diǎn)靶點(diǎn)。將與相應(yīng)成分作用的靶點(diǎn)蛋白提交STRING 版本11.5 進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，選取高置信度的蛋白相互作用數(shù)據(jù)，評分＞0.9。除去不相互作用的自由蛋白，骨質(zhì)疏松和淫羊藿苷之間共有蛋白44 個(gè)。PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，在淫羊藿苷和骨質(zhì)疏松的交叉靶點(diǎn)中有44 個(gè)蛋白和280 個(gè)相互作用邊（圖2）。

圖1 淫羊藿苷和骨質(zhì)疏松的韋恩圖

圖2 針對淫羊藿苷－骨質(zhì)疏松的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中心基因篩選 基于Cytoscape 的插件Cytohubba，在相互作用網(wǎng)絡(luò)中篩選Hub 基因。使用MCC 算法找到了目標(biāo)蛋白的前10 個(gè)Hub 基因，并構(gòu)建Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），結(jié)果顯示STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1 是淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松的重要靶點(diǎn)。

圖3 Hub 基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG 和GO 分析 用R 軟件對淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，GO功能富集分析得到1224 個(gè)生物過程（biological process，BP）、29 個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）及64 個(gè)分子功能（molecular function，MF）；KEGG 信號通路富集分析獲得152 條信號通路，并將結(jié)果可視化。篩選出BP、MF、CC 類富集程度最高的前10 個(gè)條目，BP 中以靶蛋白為主參與骨化、細(xì)胞氧化應(yīng)激、肌肉細(xì)胞調(diào)控等；MF 中靶蛋白主要參與受體配體結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性；CC 中目標(biāo)蛋白被分為質(zhì)膜和細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等。根據(jù)KEGG 分析篩選出前10 個(gè)項(xiàng)目，主要集中于TNF 信號通路、IL-17 信號通路、AGE-RAGE 通路等，見圖4。

圖4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析

圖4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析（續(xù)）

2.6 分子對接 淫羊藿核心成分淫羊藿苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示淫羊藿苷可以結(jié)合到對接分子中，與目標(biāo)蛋白之間具有良好的對接活性，見表1。共檢測了以下潛在的靶蛋白：IL-6（Icariin：1ALU）、AKT1（Icariin：1H10）、JUN（Icariin：1A02）、MAPK3（Icariin：7NRB）、SRC（Icariin：7T1U）、STAT3（Icariin：6TLC）、TGFβ1（Icariin：1KLA），它們是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的高度節(jié)點(diǎn)，在淫羊藿治療骨質(zhì)疏松中對淫羊藿苷的應(yīng)答起關(guān)鍵作用，見圖6。淫羊藿苷通過與GLN-414（長度：2.3）、TRP-413（長度：2.6）、MET-403（長度：2.7）和GLY-410（長度：2.3，2.2）形成氫鍵與IL-6 結(jié)合；淫羊藿苷與LYS-67（長度：2.3）、SER-170（長度：2.9）、MET-68（長度：2.1）、PHE-174（長度：2.7）、SER-177（長度：2.7）、GLY-410（長度：2.3、2.2）和GLU-173（長度：2.3）形成氫鍵與AKT1 結(jié)合；淫羊藿苷與JUN 形成5 個(gè)氫鍵，分別是TRP-399（長度：2.3）、GLN-457（長度：2.6、2.9）、HIS-549（長度：2.6、2.1）；淫羊藿苷與MAPK3形成6 個(gè)氫鍵，分別是GLU-122（長度：2.1）、CYS-120（長度：2.1）、GLN-68（長度：2.8）、GLU-119（長度：2.1、2.7）、LYS-187（長度：2.3）；淫羊藿苷還與SRC 通過PRO-249（長度：2.3、2.3）、GLU-150（長度：2.2）、TYR-152（長度：2.0、2.9）、GLN-147（長度：2.1）形成氫鍵；淫羊藿苷與STAT3 形成7 個(gè)氫鍵，分別是GLN-361（長度：2.4）、TYR-446（長度：3.0、2.5）、GLU-444（長度：3.3、2.6、2.6）、LYS-363（長度：2.4）。除此以外，淫羊藿苷還和TGFβ1 通過GLY-46（長度：1.8）、CYS-78（長度：2.1，2.7）、PRO-76（長度：2.2）、ALA-75（長度：2.7）、ALA-72（長度：2.9）形成氫鍵。此外，以上所有蛋白靶點(diǎn)與淫羊藿苷進(jìn)行分子對接，其結(jié)合能均＜-5 kcal/mol。

圖6 淫羊藿苷與預(yù)測蛋白靶結(jié)合的分子模型

圖6 淫羊藿苷與預(yù)測蛋白靶結(jié)合的分子模型（續(xù)）

表1 淫羊藿苷核心靶點(diǎn)的結(jié)合能

3 討論

本研究通過整合公共數(shù)據(jù)庫中關(guān)于骨質(zhì)疏松的信息來預(yù)測淫羊藿苷與其潛在蛋白靶標(biāo)之間的相互作用，并闡明淫羊藿苷參與的眾多信號通路。此外，通過分子對接研究，以預(yù)測淫羊藿苷與其預(yù)測的靶蛋白之間的特定相互作用。

淫羊藿苷的分子對接結(jié)果表明，氫鍵是相互作用的主要形式。通路分析表明，淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松中的TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Prolactin 通路，AGE-RAGE 通路等具有調(diào)控作用。同時(shí)，淫羊藿苷可通過多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)骨質(zhì)疏松的過程。其中，排名前10 位的靶點(diǎn)分別為STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1，以上可能是藥物發(fā)揮治療作用的核心靶點(diǎn)。

淫羊藿苷治療骨質(zhì)疏松的潛在原因可能歸于以下方面：首先，這些潛在靶點(diǎn)與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞密切相關(guān)。STAT3 參與多種細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)過程，在骨髓細(xì)胞分化中發(fā)揮重大作用[16]。李常虹等[17]研究表明，STAT3 在小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞模型中被證實(shí)通過降低NFATc1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。TGFβ1 是一種廣泛分布的骨基質(zhì)蛋白，影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能、形成和細(xì)胞間相互作用，以調(diào)節(jié)骨重塑和維持足夠的骨量[18]。MAPK3（ERK1）和MAPK1（ERK2）可以通過激活Runx2 基因來促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)抗骨質(zhì)疏松[19]。Kim HK 等[20]研究表明，MAPK3 和MAPK1可以受膠原蛋白水解物的刺激產(chǎn)生磷酸化，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增值和分化。破骨細(xì)胞分化因子RANKL 依賴于c-FOS 的基因轉(zhuǎn)錄，此外受外界刺激的c-JUN 細(xì)胞信號分子，可以進(jìn)一步磷酸化，通過MAPKs 信號通路，在破骨細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮作用。有研究表明[21]，c-FOS 和c-JUN 形成的異源二聚體刺激破骨前體細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化。程琳燕[22]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以明顯抑制c-FOS和NFATc1 的表達(dá)，進(jìn)而參與破骨細(xì)胞的生成。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞，并通過調(diào)控MAPK 磷酸酶和泛素途徑相關(guān)的特定基因的轉(zhuǎn)錄來抑制其分化骨穩(wěn)態(tài)[23]。其次，這些潛在靶點(diǎn)能通過影響炎癥因子、激素來調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收。有研究表明[24，25]，ESR1 是通過TGFβ 途徑和抑制IL-6 的活動來調(diào)節(jié)骨代謝。AKT 是骨穩(wěn)態(tài)的是重要一環(huán)，在AKT1 敲除的模型小鼠中，小鼠變得骨化延遲[26]、骨骼變短[27]、骨量減少[28]。另SRC 能調(diào)節(jié)雌激素依賴的ERα 靶基因的表達(dá)，有研究表明[29]，SRC 通過雌激素對骨形成起到調(diào)控作用。

綜上所述，淫羊藿苷可通過多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)骨代謝穩(wěn)態(tài)平衡，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。