炎癥對胰腺癌患者預后的評估及免疫狀態的影響

劉 基，孫振綱，鄧 巖，唐子揚

（1.長江大學醫學部，湖北 荊州 434000；2.長江大學附屬荊州醫院，湖北 荊州 434000）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是發生于胰腺組織的惡性腫瘤，早期癥狀隱匿，惡性度高，進展迅速，預后差，5 年生存率僅為2%～9%[1，2]。PAAD 風險因素包括吸煙、慢性胰腺炎家族史、糖尿病、肥胖等[3，4]，在眾多風險因素中炎癥過程已成為PAAD 發生和發展的關鍵介質[5]。炎癥和癌癥之間的功能關系是當前臨床研究的熱點之一，多項研究表明[6-8]，腫瘤微環境在很大程度是由炎性細胞協調，炎癥是腫瘤過程不可缺少的參與者，可促進其增殖、存活與轉移。本研究基于炎癥相關的PAAD 預后模型，以期為PAAD 分子機制以及預后情況提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數據收集 從GTEx 數據庫（https://xena.ucsc.edu/）中下載167 例正常胰腺樣本的RNA 測序數據，從TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載4例正常胰腺樣本和178 例PAAD 樣本的RNA 測序數據和隨訪信息，以及從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫GSE57495 和GSE62452 共下載132 例PAAD 樣本的RNA 測序數據和隨訪信息，使用制造商提供的注釋文件將探針與基因匹配，如果有多個探針與單個基因匹配，則取RNA 基因測序數據的中值，根據GTEx、TCGA 和GEO 的數據訪問政策和發行的指南（數據均為公開數據），在Molecular Signatures 數據庫（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）[9]中下載炎癥反應相關基因。

1.2 炎癥反應相關基因的預后模型構建 腫瘤樣本和正常樣本之間差異表達基因（DGEs）通過R 語言的“limma”包以logFC 大于2 和P值小于0.05 進行差異分析和篩選，單變量Cox 分析用于篩選具有預后價值的炎癥反應相關基因，并通過Benjamini&Hochberg（BH）校正方法調整P值。Lasso Cox 分析用于構建預后模型，同時縮小過度擬合的風險，使用R語言“glmnet”包用于去收縮變量，使得回歸系數相當于零，建立預后模型。用于預后分析的表達差異基因的標準化表達矩陣是自變量，在TCGA 中患者的生存期和生存狀態是因變量，根據每個炎癥反應相關基因的表達水平及其相應的回歸系數計算患者的風險評分。公式如下：分數=sum（每個基因的表達量×對應系數）。根據風險分數的中間Cut-off 值，將患者分為高風險組和低風險組。采用R 語言“scatterplot”包進行PCA 分析探討不同風險組的分布情況，采R 語言“survminer”包進行生存分析，采用“survival”R 包和“timeROC”R 包進行時間依賴性ROC 曲線分析，以評估預后特征的預測價值。此外，行單變量和多變量Cox 分析，以探討基因特征的獨立預后價值。

1.3 功能富集分析和基因富集分析 采R 語言對差異表達基因行京都基因與基因組分析（KEGG）和基因本體分析（GO）分析，使用R 語言“bioconductor”包行基因名和富集通路名稱的匹配，以差異基因表達譜為變量，以KEGG 和GO 分子特征和通路的表達譜為參考，同時計算logFC 值，P值根據BH 方法進行調整。使用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”“enrichplot”包進行KEGG 和GO 富集分析，使用R語言“digest”“GOplot”包進行基因和富集通路聯系分析，以logFC 值為表示兩者之間的關系度。

1.4 特征基因驗證 為了測試從TCGA 隊列構建的模型穩定性和胰腺癌生存狀態和時間的影響因素，GEO 數據庫中GDE57495 和GSE62452 的患者也根據TCGA 隊列的風險系數取中間Cut-off 值分為高風險組或低風險組。

1.5 腫瘤微環境和免疫反應分析 將200 個炎癥基因用R 語言“limma”包進行數據矯正，使用R 語言“estimate”包給每個樣本行腫瘤環境、免疫環境、腫瘤純度進行評分，使用“pheatmap”繪制高、低風險組在腫瘤免疫微環境的表達情況，使用R 語言“ggpubr”包分析高、低風險組在不同腫瘤免疫微環境的表達差異。

1.6 生存預測列線圖的建立與評估 為了準確預測1、2、3 年的總生存率（0S），通過整合年齡、性別、風險分數構建預后列線圖，Harrell’s 一致性指數（C 指數）評估預測準確性，C 指數范圍從0.5（無預測能力）到1（完美預測）。校準圖用于評估列線圖的性能特征。

1.7 數據分析 采用Wilcoxon 檢驗比較癌癥組織和正常組織之間的差異表達基因，采用Kaplan-Meier分析比較各組OS 差異。采用單變量和多變量Cox分析篩選OS 的獨立預測因子。使用estimate 包對各組腫瘤進行基質細胞評分、免疫細胞評分、綜合評分（基質細胞評分+免疫細胞評分）、腫瘤純度評分。R軟件（版本4.1.1）和軟件包ggplot2、igrph、pheatmap、ggpubr 和survminer 被用來創建平面圖。雙尾P值小于0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥相關差異表達基因的識別 共得到29 個差異表達基因，見圖1A、1B。除HPN 基因在正常組織中表達高于腫瘤組織，其余基因在腫瘤組織表達均高于正常組織（P＜0.05）；單變量COX 分析顯示，17個基因與OS 相關，MET 基因的風險率為1.960（95%CI1.555～2.470，P＜0.001），見圖1C、1D。

圖1 TCGA 和GTEx 數據序列中識別炎癥相關差異表達基因

2.2 炎癥相關基因預后模型的構建 將差異基因用Lasso Cox 方法進行分析，構建預后模型，根據最佳λ 值確定了6 個標記基因（圖2A、2B），風險分數根據score=0.047×CXCL9 的基因表達量+0.028×LY6E的基因表達量+0.038×HBEGF 的基因表達量+0.524×MET 的基因表達量+0.096×CXCL10 的基因表達量+0.051×RTP4 的基因表達量進行計算，根據中間Cut-off 值劃分為高、低風險組（圖2C）；散點圖顯示，高風險組患者比低風險的患者預后差（圖2D）；PCA 分析顯示，患者在高、低風險組中可以被分為兩個不同方向（圖2E）；Kaplan-Meier 曲線顯示，高風險組總體生存率OS 低于低風險組（P＜0.05，圖2F）；ROC 曲線分析顯示，曲線下面積（AUC）等于0.774，表明預后模型準確性較高（圖2G）。使用GEO數據庫測試在TCGA 數據庫中構建模型的穩定性，從GEO數據庫抽取GSE57495、GSE62452 根據TCGA 數據風險分數的計算方法和中間值將患者劃分為高風險組和低風險組，得到的結果和TCGA 相類似（圖2I），PCA 將患者劃分為兩個方向的分布（圖2H），患者在高風險組較低風險組提前死亡（圖2J），并且相對低風險組生存期更短（圖2K）；此外，6個基因AUC 曲線是0.632（圖2L）。

圖2 6 個預后基因在GEO 和TCGA 預后模型的分析

2.3 胰腺癌的預后因素 單因素Cox 分析顯示，風險評分和OS 相關（HR=3.19，95%CI=2.077～4.911，P＜0.001）；在糾正其它混合因素后，多因素Cox 分析顯示，風險評分也和OS 相關（HR=3.302，95%CI=2.074～5.260，P＜0.001）；ROC 曲線分析顯示，風險分數具有良好預后預測準確度，且PAAD 具有良好的預后價值，見圖3。

圖3 胰腺癌的預后因素

2.4 生物功能和通路富集分析 通過GO 富集分析顯示，29 個差異表達基因在PAAD 患者的生物進程（BP）主要在細胞趨化作用、細胞對脂多糖的反應、細胞對細菌起源分子的反應、細胞對生物刺激的反應、骨髓白細胞游走等5 個進程占主導作用，癌癥細胞主要有膜錨定構件、分泌顆粒膜、膜筏、膜微區等主要細胞組分（CC），分子功能（MF）主要是受體配體活動、信號受體激活物活性、細胞因子活性、G 蛋白偶聯受體結合等分子功能參與活動（圖4A）。通過KEGG 富集分析顯示，29 個差異表達基因主要參與細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用生物功能及腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路、Toll 樣受體信號通路（圖4B）；同時，建立這些通路和基因之間的聯系（圖4C～圖4F）。

圖4 生物功能和富集通路分析

圖4 生物功能和富集通路分析（續）

2.5 免疫活性和腫瘤微環境分析 低風險組免疫通路較高風險組更加活躍（圖5A），另低風險組免疫評分、腫瘤評分和免疫及腫瘤微環境綜合評分高于高風險組，相反腫瘤純度呈現相反趨勢，腫瘤純度從低風險到高風險組呈上升趨勢（Kruskal-Wallis test，P＜0.01，圖5B～圖5E）。

圖5 免疫活性和腫瘤微環境

圖5 免疫活性和腫瘤微環境（續）

2.6 建立列線圖對總生存率進行預測 在TCGA 數據中，基于年齡、性別、風險分數預后因素建立關于PAAD 患者總生存率的列線圖（圖6A），校準圖進一步證實列線圖能夠較好的預測患者2、3 年的總體生存率，是一個較好的預測模型（圖6B、圖6C）。

圖6 列線圖的構建

3 討論

隨著精準醫學和公共衛生的發展，PAAD 得到了較好的治療以及控制，然而因為實用標記物較少，現在仍然無法有效的進行早期診斷以及PAAD 患者治療評估。CA199 作為PAAD 中的一種診斷性腫瘤標志物的作用已被證實，由于受到宿主炎癥反應和梗阻性黃疸的干擾，從良性疾病中準確診斷PAAD 的個體能力較低[10，11]。然而，作為PAAD 預后因子的炎癥反應相關基因標記物極少報導。既往研究表明[12-14]，鐵死亡相關基因、免疫相關基因、m6A相關基因顯著影響PAAD 預后。本研究中構建的炎癥反應相關基因與上述基因相比具有更多優勢，如本研究結合了GTEx 數據庫中更多的正常樣本，使得差異基因更加具有差異性，同時探索了免疫活性和腫瘤微環境在高、低風險組的表達狀態，并且構建列線圖對2、3 年PAAD 總體生存率進行預測。

本研究建立的預后模型由6 個炎癥反應相關差異表達基因組成（CXCL9、LY6E、HBEGF、MET、CXCL10、RTP4），這些基因在PAAD 中均上調。CXCL9、CXCL10 屬于趨化因子，與腫瘤微環境中免疫環境變化有關，其中CXCL9 可以通過STAT3 信號通路影響CD8+T 細胞，CXCL9 表達量的提升會抑制CD8+T 細胞的抗腫瘤細胞因子的增殖、活化、分泌[15-17]，而CXCL10 可以通過其受體CCR7 和CXCR3 促進PAAD 細胞的遷移[18]，HBEGF 可以誘導EGFR 核轉位和組蛋白H4 甲基化，進而介導EGFR 的代謝激活，而EGFR 配體的轉錄上調引起EGFR 信號的傳導，導致谷氨酰胺饑餓，從而促進體外胰腺腺泡細胞DNA 損傷的消退。在刺激YES 相關蛋白（YAP）的活性時，則影響PAAD 的生存預后[19-21]。RTP4 由Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）誘導，并與TANK 結合激酶（TBK1）復合物結合，通過干擾TBK1 和IFN 調節因子3 的表達和磷酸化來負調節TBK1 信號傳導[22]。本研究中通過對PAAD 預后模型的構建，進一步驗證此6 個PAAD 相關炎癥基因可以作為PAAD 預測分子。

已有研究表明[23]，Toll 樣受體（TLR）在炎癥和免疫反應中起關鍵作用，其主要參與病原體相關分子模式（PAMP）和危險相關分子模式（DAMP）。本研究在免疫微環境分析中，高風險組患者的免疫細胞浸潤、抗腫瘤免疫活動及兩者綜合活動均較多，表明高風險組患者的免疫功能整體受損，免疫活動的增加可以解釋低風險組患者具有良好的臨床結果，然而高風險組的腫瘤純度高于低風險組，這表明不良預后與腫瘤微環境無關。同時，有研究表明先天免疫系統由已經存在于體內的免疫細胞組成，這些細胞可以立即被招募到感染部位。天然免疫細胞包括粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞（NK）和樹突狀細胞（DC）。中性粒細胞通常會觸發對炎癥的快速反應并分泌細胞因子，而成熟后，巨噬細胞可以分化為M1 和M2 極化細胞，進而抑制炎癥反應和促進腫瘤的生長[24]，這同本研究中低風險人群在免疫浸潤活動是一致的。

綜上所述，炎癥反應相關基因的預后特征是預測PAAD 患者預后的良好工具，但仍需要進一步的研究證實。