啟動模式對水稻秸稈厭氧發酵穩定性及產氣效率的影響

凡 慧，馬詩淳,4*，李 強,4，黃 艷，王春芳，鄧 宇,4

(1.農業農村部沼氣科學研究所，四川 成都 610041；2.農村可再生能源開發與應用重點實驗室，四川 成都 610000；3.國家農業微生物雙流觀測實驗站，四川 成都 610000；4.三亞中國農業科學院國家南繁研究院，海南 三亞 572024)

秸稈富含纖維素、半纖維素等有機成分，是生產清潔生物能源的重要基質[1-3]。我國秸稈年產量8億噸左右，全部利用可減排9億余噸CO2。加快推進秸稈的能源化利用，將有效支撐農業減排固碳，助力我國2030年實現“雙碳”目標。厭氧消化是秸稈能源化利用的重要途徑之一。但是，由于秸稈結構復雜、生物轉化率低、碳氮比高等[4-5]，導致厭氧發酵過程不穩定、易酸化，從而限制了其在沼氣發酵中的大規模應用[6-8]。

目前，秸稈厭氧發酵主要采用濕式厭氧發酵工藝和干發酵工藝[9]。濕式發酵通常以較低的負荷運行(<8% TS)，以避免纖維和脂肪等分層、形成浮渣，但嚴重影響沼氣產量[10-11]。秸稈厭氧干發酵可通過提高發酵負荷(>15% TS)提升沼氣產量，但是啟動周期長，并且由于傳質差、營養不平衡、氨氮和揮發酸易積累，容易導致纖維素降解率低等問題[12]。多項研究證實[13]，秸稈厭氧發酵過程中，TS含量的提高易造成揮發酸累積和pH值，破壞產酸和產甲烷代謝平衡，當有機酸高達7000 mg·L-1時，產甲烷代謝將被抑制，從而導致系統崩潰。研究發現，啟動階段，接種是影響秸稈厭氧消化過程的重要步驟[14]。增加接種率可提升甲烷產量，但當底物/接種物比率(S/I)>4時，由于接種物中的微生物缺乏足夠的底物維持生長代謝，從而導致厭氧消化效率將下降，甚至啟動失敗。但是，接種率過高，不僅增加運行成本，還將減少反應器的有效容積和發酵原料，增強微生物之間的營養競爭，從而降低產氣量[15]。目前，高濃度物料發酵常采用沼液回流等模式進行連續接種，提高活性微生物的數量，緩解揮發性脂肪酸積累，從而縮短啟動周期、維持運行的穩定性、提高沼氣產量。但是，沼液回流模式容易造成氨氮積累，進而抑制厭氧降解過程[16]。在適宜的接種率下，利用逐級提高進料濃度的方式啟動厭氧發酵，可增強厭氧消化菌群的代謝活性，從而提升其降解有機廢棄物的能力。目前已利用該模式成功地進行了厭氧消化處理雞糞的啟動，總固體含量(total solid, TS)去除率60%，甲烷體積分數穩定在(65±3)%左右，并避免了氨抑制的現象[17]。

本研究圍繞提升秸稈的轉化效率，維持秸稈厭氧發酵過程的穩定性，在恒溫35℃條件下，以馴化的厭氧污泥為接種物，在不同原料濃度(5%，7%和9% TS)下，通過分析厭氧發酵過程中的揮發酸代謝、沼氣產率、木質纖維素降解率以及微生物群落結構等差異，評估了一步啟動(OSS, one-step startup)和逐級提升啟動(SIS, stepwise-increasing startup)模式對水稻秸稈厭氧中溫發酵性能的影響，以期為秸稈沼氣工程運行提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料及接種物

1.1.1 實驗原料

實驗中所采用的水稻秸稈取自成都雙流農田，其成分主要包括纖維素(33.55%)、半纖維素(21.46%)、木質素(17.38%)、灰分、蛋白質和糖等，組成特征見表1。水稻秸稈使用前先烘干后粉碎，40目過篩。稱取1.00 g，55℃烘干至恒重，通過失重法計算秸稈含水率。

1.1.2 接種物

接種物為實驗室利用豬糞秸稈混合原料長期馴化的厭氧干發酵菌劑，接種物的理化特征見表1。

表1 底物和接種物理化性質

1.1.3 培養基成分及配制方法

FSC培養基(g·L-1)：NaCl 5.0，CaCO32.0，尿素2.0，胰蛋白胨(BBL)2.0，酵母粉(YE)1.0，將上述試劑溶解于1 L自來水。配置時，先將秸稈粉加入1.0 L發酵瓶中，真空泵抽換氮氣3次，每次5 min，然后分裝0.5 L FSC培養基于厭氧瓶中。

1.2 實驗設置

本實驗設置為批次實驗，分別采用一步啟動(OSS, one-step startup)和逐級提升啟動(SIS, stepwise-increasing startup)兩種模式啟動秸稈厭氧發酵實驗，原料濃度分別選擇5%、7%和9% TS，累積設置6個實驗組。以兩種不同模式啟動厭氧發酵實驗。OSS組(OSS 5, OSS 7和OSS 9)以5%、7%和9% TS直接啟動厭氧消化系統，SIS組(SIS 5，SIS 7和SIS 9)均先以2% TS啟動厭氧消化系統，至系統穩定運行后將TS分別提高至5%、7%和9%。

采用1.0 L帶有取樣口和排氣口的發酵瓶，實際發酵體積為0.5 L，接種量為10%(w/v)。接種后放置于(35±1)℃恒溫培養箱中培養，每2 d搖晃混勻1次并取樣監測，直至沒有明顯產氣時停止實驗。

1.3 理化指標分析

采用標準方法分析總固體含量(total solids, TS)和總揮發性固體含量(volatile solids,VS)[18]。采用Vario Macro Cube元素分析儀分析C、H、N和S元素。采用排飽和鹽水集氣的方法測定沼氣產量。采用安捷倫7820A型氣相色譜儀測定甲烷含量[19]。將液體樣品于室溫下12000 rpm 離心10 min，經0.22 um水相濾膜過濾，用Agilent 1200 Series液相色譜儀分析揮發性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸)[20]。采用納氏試劑分光光度法測定氨氮[21]。采用范氏 洗滌纖維分析法測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)[22]。纖維素降解率用以下公式計算：

(半)纖維素降解率(%)=(降解前纖維素量-降解后纖維素量)/降解前纖維素量×100%

1.4 微生物群落結構分析

實驗運行至穩定期，用無菌離心管從每個反應體系中收集5 mL樣品，于4℃，12000 rpm離心10 min，用PBS緩沖液清洗2～3次，菌體儲存于-80℃冰箱保存用于DNA提取。采用TIANGEN細菌基因組提取試劑盒提取、純化基因組 DNA。

采用Illumina Miseq系統進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。采用FLASH、Trimmomatic軟件對測序數據進行拼接和優化；使用Usearch 軟件進行OTU聚類分析；基于得到的OTU-table，進行后續的分類學分析、Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析以及組間差異分析。數據分析采用Qiime(Version 1.8 http://qiime.org/)平臺在線分析，根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，對97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。采用RDP Classifier算法(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)對OTU代表序列進行比對分析，在各個水平(kingdom，phylum，class，order，family，genus，species)注釋其群落的物種信息。并對樣品進行了多樣性分析以及分類分析。

2 結果與討論

2.1 啟動模式對揮發性脂肪酸代謝的影響

在秸稈厭氧消化過程中，所有實驗組的乙酸、丙酸、丁酸和總揮發性脂肪酸(VFAs)濃度變化趨勢幾乎一致(見圖1)。發酵前4 d為快速水解階段，有機物水解導致VFAs迅速累積。OSS實驗組的VFAs濃度且伴隨TS提高而增加，發酵第4天達到最高值3072.0～6556.7 mg·L-1；SIS實驗組以2% TS啟動時和提高至目標負荷階段均出現VFAs快速累積，最高累積濃度分別為1209.1～1412.1 mg-1(第4天)和(第22～24 天)110.4～730.2 mg-1，均不足OSS實驗組的40.3%。同時，提升負荷階段VFAs濃度顯著低于初始啟動階段，這可能與SIS實驗組處于穩定的VFAs降解狀態有關(見圖4)。

圖1 秸稈厭氧發酵過程中乙酸產量變化

圖2 秸稈厭氧發酵過程中丙酸產量變化

圖3 秸稈厭氧發酵過程中丁酸產量變化

注：揮發性脂肪酸包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸

乙酸和丙酸為水解階段的主要代謝產物，占揮發酸總量的60.5%以上(見圖5)。其中，前2天為乙酸型發酵，乙酸占VFAs的48.1%以上，乙酸/丙酸比率為2.4～3.9。第4天起，OSS實驗組轉換為丙酸型發酵(乙酸/丙酸比率為0.6～0.9)，乙酸緩慢增加或快速降解，丙酸則迅速積累，分別是第2天的0.78～1.3倍和4.4～5.7倍；而SIS實驗組在整個發酵過程中均為乙酸型發酵(乙酸/丙酸比率為1.5～2.7)，發酵第4天乙酸和丙酸均緩慢提高，是第2天的1.0～1.2倍和1.2～2.2倍。發酵第6天，OSS實驗組進入乙酸降解階段，2天內乙酸降解率超過56.7%，丙酸降解率不足15.7%；而SIS實驗組則以丙酸降解為主，2天內丙酸降解率超過75.0%，乙酸降解率為33.2%～61.0%。乙酸和丙酸是有機物厭氧轉化過程中的重要中間產物。由于乙酸可以直接被產甲烷菌利用，而丙酸的電離常數大，并且轉化為甲烷的速率慢，因此在厭氧消化過程中，丙酸最容易積累，從而導致系統失衡[23-25]。一般認為，厭氧發酵系統中適宜的丙酸濃度應不高于1500 mg·L-1(2.3 g HPr·L-1COD)[25]。當發酵體系中的丙酸濃度積累至>2000 mg·L-1以上，且影響正常產甲烷代謝時，將導致丙酸型酸化[26-27]。OSS實驗組中，發酵4～8 d期間，除5%TS實驗組，其余實驗組的丙酸濃度均大于1500 mg·L-1，其中9%TS實驗組丙酸濃度高于2254.1 mg·L-1；在持續56 d的發酵過程中，SIS實驗組丙酸濃度始終維持較低的濃度，即使在負荷提升階段丙酸濃度均低于498.8 mg·L-1。因此，一步啟動高濃度的秸稈厭氧發酵過程具有較高的丙酸型酸化風險，而逐級提升啟動模式可以建立高效的丙酸水解體系，加速VFAs轉化，維持較穩定的乙酸型發酵過程，預防厭氧消化系統酸化。

圖5 水解階段(第2～8天)乙酸、丙酸和丁酸產量的比例

2.2 啟動方式對產甲烷代謝的影響

由圖6和圖7可知，所有實驗組啟動第2天即開始產甲烷，甲烷含量持續增加。發酵第4天，OSS實驗組甲烷含量可達34.4%～44.0%，SIS實驗組為31.7%～40.7%；OSS實驗組和SIS實驗組分別在發酵第18天和第16天進入產甲烷代謝穩定期，甲烷含量分別為62.8%～63.9%和58.6%～61.3%。SIS實驗組于發酵第19天提升負荷后進行了頂空氣體置換，但2天后(第22天)甲烷含量即達到19.9%～37.7%，5%、7%和9% TS組分別于16(第36天)、10(第30天)和12天后(第32天)進入產甲烷代謝穩定期。在持續56天的厭氧發酵過程中，即使在VFAs迅速積累的水解階段和丙酸濃度>2000 mg·L-1時，所有實驗組均可正常進行產甲烷代謝，未發生酸抑制現象，這可能與所使用的接種物中含有較高豐度的丙酸互營氧化細菌和產甲烷菌有關[28]。

圖6 秸稈厭氧發酵過程中甲烷含量

圖7 秸稈厭氧發酵過程中累積產氣量

發酵結束時，SIS 5、SIS 7和SIS 9實驗組的TS產氣率分別為197.7±2.7、213.0±26.0、253.6±8.3 mL·g-1TS(見圖8)，VS產氣率分別為231.2±3.2, 249.2±30.4, 296.6±9.7 mL·g-1VS(見圖9)，較OSS 實驗組分別提高14.8%，10.1%和18.0%，但僅9%TS實驗組的原料產氣率在兩種啟動模式下具有極顯著差異(p<0.01)。

注：**，差異顯著p<0.05;***差異極顯著p<0.01

注：**，差異顯著p<0.05;***差異極顯著p<0.01

2.3 秸稈纖維素降解率

啟動模式對秸稈中半纖維素、纖維素和木質素的降解具有明顯的影響(見圖10～圖12)。當TS為5%時，SIS實驗組的半纖維素與纖維素降解率分別為(32.9±0.3)%和(41.5±2.7)%，顯著高于OSS實驗組，較OSS實驗組分別提高65.1%和49.3%；但木質素降解率為(24.4±0.3)%，低于OSS實驗組7.2%。TS為7%時，SIS實驗組的半纖維素與纖維素降解率分別為(28.0±4.3)%和(29.8±1.0)%，較OSS實驗組分別提高14.0%和8.0%；木質素降解率為(18.7±3.3)%，低于OSS實驗組27.5%。TS為9%時，SIS實驗組的半纖維素與木質素降解率分別為(27.2±1.2)%和(18.6±8.6)%，較OSS實驗組分別提高4.8%和31.8%；纖維素降解率為(22.5±1.6)%，低于OSS實驗組31.1%。因此，SIS對低濃度秸稈發酵過程中的半纖維素和纖維素轉化率具有顯著的促進作用，但不利于木質素降解；高濃度秸稈發酵過程中，SIS可在一定程度上提高半纖維素降解率，但OSS更有利于纖維素降解。

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

2.4 啟動模式對微生物群落結構組成的影響

發酵穩定期，5%和9%TS時，4種發酵條件下共注釋到1102個OTU，其中OSS和SIS實驗組分別注釋到930和 766個OTU，各組的特有OTU數量分別為122個和45個(見圖13)，占每組OTU總量的13.1%和5.9%，暗示著微生物種群在逐級提升啟動模式下趨向于富集，而在一步啟動模式下趨向于分化。此外，OSS 5和OSS 9實驗組、SIS 5和SIS 9實驗組分別注釋到695、815、564和652個OTU(圖14和圖15)，這說明OTU多樣性隨著秸稈發酵濃度的升高而增加。其中，各實驗組共有OTU 339個，占OTU總量的30.8%；OSS 5、SIS 5、OSS 9和SIS 9實驗組注釋到的特有OTU數量分別為59、32、155和95個，分別占各組OTU總數的8.5%、5.7 %、19.0%和14.6%，因此，發酵負荷可能是推動微生物種群分化的重要影響因素，高物料濃度可驅動形成更獨特的微生物種群結構。

圖13 發酵穩定期微生物OTU組成Venn圖

2.5 不同啟動模式下微生物群落結構的差異

當發酵原料TS為5%和9%時，OSS和SIS兩種啟動方式分別對秸稈纖維素水解和原料產氣率有顯著影響。為了揭示啟動方式對高濃度秸稈厭氧消化過程中微生物的影響，探究維持發酵穩定性、促進產甲烷代謝的關鍵微生物，采用高通量測序技術，對不同啟動模式下5%和9% TS實驗組在穩定產氣階段的微生物群落結構進行了分析。

細菌屬水平分析結果顯示，一步啟動法和逐步提升啟動法對細菌群落結構組成具有明顯的影響(見圖14)。OSS實驗組的優勢物種(相對豐度≥5%)為Sphaerochaeta(5%和9% TS實驗組分別為16.8%和18.6%),Proteiniphilum(3.6%和7.8%)[29]和 OPB54(3.0%和5.6%)等。Sphaerochaeta廣泛分布在白蟻腸道、以纖維素為原料的厭氧發酵系統、油藏環境[30]，已分離的純培養物具有降解纖維二糖和核糖等纖維素、半纖維素水解產物，并產生乙酸、丙酸和丁酸的能力[31-34]。Proteiniphilum是中溫厭氧反應器中常見的一類水解性細菌，具有多種多聚糖水解酶活性(如β-葡聚糖、淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、CM-纖維素和PASC)，可降解纖維二糖、葡萄糖、等半纖維素和纖維素水解產物，以及蛋白胨、酵母粉和多種多肽，產生乙酸和丙酸[35-36]。在間歇性木質纖維素微耗氧發酵過程中發現，Proteiniphilum可以通過交替進行好氧呼吸和厭氧發酵直接降解木質纖維素產生二氧化碳、甲酸和乙酸[37]。基于多組學分析推測，在厭氧發酵微生物組中，Proteiniphilum和Petrimonas可能是厭氧發酵過程不穩定的代表性指標[38-39]。OPB54是芽孢桿菌門(Bacillota，舊名厚壁菌門，Firmicutes)的一個未培養的類群，在纖維素富集物、秸稈、牛糞和蔬菜廢棄物的高溫干發酵過程中為優勢物種，也是含有高濃度乙酸的厭氧反應器中豐度最高的互營乙酸氧化菌[40]。該類群中最近分離培養的Hydrogenispora可以降解幾丁質，以及木糖、葡萄糖等多種單糖和多糖，產生乙酸、乙醇、氫氣等，尚未證實具有乙酸互營氧化能力[41-42]。SIS實驗組的優勢物種為vadinBC27 wastewater-sludge group(5%和9% TS實驗組分別為15.7%和25.2%), uncultured Synergistaceae(9.6%和12.3%)和OPB54(6.0%和1.6%)等。研究發現，vadinBC27 wastewater-sludge group和uncultured Synergistaceae是牛糞干發酵、人工廢水厭氧發酵產酸過程中的優勢物種[43-44]。其中，vadinBC27 wastewater-sludge group屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，但功能尚不清楚。目前已分離的擬桿菌門成員多數具有降解纖維素、木聚糖、幾丁質等多聚糖的能力。Synergistaceae成員和部分uncultured Synergistaceae具有氨基酸、乙酸互營氧化代謝能力，有利于促進VFAs等厭氧發酵的中間代謝產物降解產甲烷[45-46]。在OSS實驗組中，優勢物種的相對豐度隨著TS的增加而提高，暗示其在纖維素厭氧降解過程中具有重要的作用，可能與VFAs積累有關。而SIS實驗組中Sphaerochaeta(5%和9% TS實驗組分別為3.7%和1.6%)和Proteiniphilum(0.5%和0.4%)的相對豐度顯著低于OSS實驗組，且隨著TS濃度的增加而降低，這可能是其半纖維素、纖維素降解率低于OSS實驗組的原因。同時，SIS實驗組中高豐度的Synergistaceae可能與發酵過程中維持較低的VFAs有關，而OSS實驗組中，該類群僅占1.6%～3.8%。但是，所有實驗組中均具有多種互營VFAs氧化菌，包括互營短鏈脂肪酸/長鏈脂肪酸(C4及以上)氧化菌Syntrophomonas[47-48]、互營丙酸氧化菌Pelotomaculum[49-50]，以及乙酸氧化菌Mesotoga[51]，在OSS和SIS實驗組的相對豐度分別為1.8%～2.0%和4.6%～5.3%，這可能是發酵過程中參與乙酸、丙酸和丁酸降解的關鍵細菌類群。

圖14 不同啟動模式下細菌的群落結構和相對豐度

不同啟動模式下，氫營養型產甲烷菌Methanoculleus是秸稈厭氧發酵過程中的優勢古菌(見圖15)，同時還包括未培養古菌Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)。MCG主要發現于海洋沉積物、淡水環境，包括具有氨氧化和硫代謝等功能的多個亞群[52]，在不同啟動模式下，MCG的相對豐度無顯著差異。此外，OSS實驗組中氫營養型產甲烷菌Methanoculleus(5%和9%TS實驗組分別為70.1%和75.6%)的相對豐度高于SIS實驗組(55.6%和60.1%)。然而，SIS實驗組的氫營養型產甲烷菌Methanobacterium(13.8%和10.4%)顯著高于OSS實驗組(2.2%和3.0%)。在較低的氫分壓下，Methanobacterium對氫氣具有較高的親和力，在短鏈脂肪酸互營氧化過程中參與種間電子傳遞[53]。由此推測，SIS實驗組中較高豐度的Methanobacterium可能與互營氧化細菌Synergistaceae、Syntrophomonas和Pelotomaculum之間存在互營代謝關系，從而維持較低濃度的VFAs。同時，與5%TS實驗組相比，9%實驗組中具有較高豐度的Methanosarcina，且SIS實驗組的相對豐度(15.1%)顯著高于OSS實驗組(5.9%)，有利于乙酸和氫氣/二氧化碳的消耗，維持發酵的穩定性。

圖15 不同啟動模式下古菌的群落結構和相對豐度

3 結論

啟動模式對水稻秸稈中溫厭氧發酵性能具有顯著的影響。一步啟動模式有利于乙酸的快速降解，趨向于形成丙酸型發酵。逐級提升啟動模式有利于促進丙酸和乙酸等VFAs的轉化，避免VFAs積累，建立持續的乙酸型發酵，維持發酵系統的穩定性；同時，在較高的物料濃度下，可顯著提升沼氣產率。此外，逐級提升啟動模式可顯著提高較低濃度秸稈中的半纖維素、纖維素降解率，改善高濃度秸稈的半纖維素降解率，但不利于木質素的降解。

啟動模式差異推動秸稈厭氧消化系統形成了不同的微生物群落結構。一步啟動發酵系統中富集了Sphaerochaeta,Proteiniphilum和 OPB54等多聚糖、糖類水解細菌，有利于秸稈纖維素快速水解產酸；逐級提升啟動模式富集了uncultured Synergistaceae等多種互營氧化細菌。氫營養型產甲烷菌Methanoculleus是秸稈厭氧消化系統中的絕對優勢古菌，逐級提升啟動模式下富集的氫營養型產甲烷菌Methanobacterium可能與uncultured Synergistaceae、Syntrophomonas和Pelotomaculum等多種互營氧化細菌協同作用，促進氨基酸和VFAs等水解產甲烷，從而維持發酵系統的穩定性，提高沼氣產率。