天然低共熔溶劑超聲輔助高效提取海茸多酚與多糖的研究

＊劉玉坤 劉凌雯 孔晶 費玉清 徐林 陳正件

（珠海中科先進技術研究院有限公司 廣東 519000）

南極海茸（Durvillaea antarctica）是一種可食用的大型褐藻，對生長環境要求十分嚴苛，主要分布在南極洲、智利南海沿岸未經任何污染的海域中。其富含膳食纖維、維生素、礦物質、多糖等生物活性成分，具有良好的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化活性，預防肥胖和大腸癌等功效。因此，其在食品、醫藥以及化妝品行業中具有廣泛的應用。

近些年，天然低共熔溶劑（NADES）作為綠色、環保、無毒且高效溶劑，廣泛應用在生物和化學領域，包括無機材料的制備、有機合成、生物提取和分析化學等方向。一般情況下，NADES由兩種天然成分組成，一種作為氫鍵受體（HBA），比如季銨鹽、膽堿和磷酸鹽等；另一種作為氫鍵供體（HBD），通常是基于天然植物的有機物，例如,氨基酸、羧酸和糖等。此外，NADES的制備也特別簡單，可以通過對混合物加熱的方式制備而成。由于氫鍵的相互作用，使得NADES可以和水混溶，具有低于任一組分的熔點和較高的黏度，并且可以有效地從植物中提取極性和非極性的天然產物，如藥物、香料、天然色素等。

基于上面表述的原因，本次實驗建立了一種環境友好型的提取方法，利用9種NADES作為提取劑萃取海茸的多酚和多糖，為更有利于開發利用海茸提供了理論數據依據。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

海茸絲干貨（山東海洋食品有限公司）；左旋肉堿（美國Ark Pharm公司）；順丁烯二酸、檸檬酸、苯酚、蘋果酸、酒石酸、丙二酸、丙酸、脯氨酸、草酸、葡萄糖、丁二酸、過硫酸鉀、Vc（國藥集團化學試劑有限公司）；無水碳酸鈉（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；Folin-Ciocalteu試劑（GOLD WHEAT）；沒食子酸（上海泰坦科技股份有限公司）；濃硫酸（上海穗試公司）。

Master-Q 15去離子純水機（上海和泰儀器有限公司）；H1850臺式離心機（湖南湘儀離心機有限公司）；KQ-300E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；SynergyHTX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

(2)實驗方法

NADES的制備

將左旋肉堿與氫鍵供體（順丁烯二酸、草酸、脯氨酸、蘋果酸、丙二酸、丙酸、檸檬酸、丁二酸和酒石酸）按照試驗摩爾比1:1混合，加入規定質量的去離子水，在室溫下用超聲（40kHz，30W）15～30min，直到發生成穩定、透明、均一的NADES溶液。在本文中，選取左旋肉堿作為氫鍵受體與9種氫鍵供體合成提取劑，見表1。

表1 低共熔溶劑組成及編號Tab.1 Composition and numbering of NADES

(3)超聲輔助提取

將海茸用粉碎機打碎，過100目篩得到海茸粉末樣品，用于后續的提取實驗。

①多酚的提取

用乙醇作為對照，以料液比1:20（質量/g:體積/mL）將海茸粉分別與9種NADES提取劑（50%含水量）以及對照提取劑裝入50mL離心管中，室溫下超聲（40kHz，30W）30min，1000rpm離心10min，取上清，得到提取液，4℃冰箱保存，待測多酚含量。

②多糖的提取

以去離子水為對照，按照上述的料液比和實驗條件進行。離心后收集上清液，向沉淀試液中加入20mL去離子水進行充分洗滌，以1000rpm離心10min，收集試液上清液，再重復洗滌三次，合并之前試驗上清液并用去離子水定容至100mL，得到多糖提取液，4℃冰箱保存，待測多糖含量。

(4)含量的測定

①沒食子酸標準曲線的繪制及多酚含量測定

準確稱取20.0mg沒食子酸，用去離子水定容至100mL，得到0.2mg/mL標準溶液。依次取0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL和10.0mL標準溶液用去離子水定容至10mL，搖勻備用。取200μL不同濃度的標準液加入1mL Folin-Ciocalteu（0.25M）試劑，劇烈振蕩搖勻后加入lmL 10%碳酸鈉溶液，震蕩搖勻后，加入2.8mL去離子水，室溫避光90min，吸取200μL待測液置于96孔板中，在765nm處測定吸光度。用去離子水作對照，以吸光度、濃度繪制標準曲線。待測樣品按照標準曲線的方式進行測定吸光值，通過標曲計算其濃度。

②多糖含量的測定

吸取葡萄糖標準溶液（0.1mg/mL）0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL置于試管中，各加蒸餾水至補足體積2mL，再加6%的苯酚溶液1mL，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，搖勻后放置30min，吸取200μL待測液置于96孔板中，于490nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度與吸光度做標準曲線。待測樣品按上述方法進行多糖含量測定，根據標準曲線計算濃度。

2.結果分析

(1)NADES對多酚提取量的影響

由于低共熔溶劑具有兩親性，不僅對水溶性多糖有一定的提取效果，還可以提取一些包括多酚在內的極性物質，NADES對海茸多酚的提取如圖1所示。

圖1 海茸多酚的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of polyphenol from Durvillaea antarctica

通過圖1可知，作為對照組的乙醇對海茸多酚的提取效率為0.20mg/g，而9種NADES對海茸多酚的提取效率均顯著地高于乙醇（P＜0.05）。在所有的NADES中，NADES-6對多酚的提取率為2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且顯著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。由于NADES具有兩親性，可同時與多酚的極性基團和非極性基團具有相互作用力，因此難以簡單地將提取效率與NADES的極性相關聯。另外研究表明，相比于普通有機溶劑，NADES對植物細胞壁的破壞能力更強，這就導致更多的酚類物質被釋放到提取液中，因此，NADES的提取效果要顯著地優于乙醇的提取效果。

(2)NADES對多糖物質提取的影響

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均稱為多糖，NADES對海茸多糖的提取率如圖2所示。

圖2 海茸多糖的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of Polysaccharide from Durvillaea antarctica

從圖2中可以看出，水對海茸多糖的提取量為126mg/g，9種NADES對海茸多糖的提取量均高于水的提取效果。其中NADES-6提取的多糖含量顯著地高于水提取多糖的量，多糖含量達到231mg/g，是水提取的1.83倍。NADE-7對多糖的提取效率為214mg/g，與NADES-6的差異不顯著。因此，兩者都可以顯著地提高海茸多糖的提取量。這可能是由于NADES具有較高的氫鍵結合能力以及可以與多糖發生靜電相互作用的原因引起的。

3.小結

采用超聲波輔助提取法，利用9種左旋肉堿作為氫鍵受體的NADES對海茸進行提取，由左旋肉堿和脯氨酸組合形成的NADES-6對多酚的提取率為2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且顯著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。此外，NADES-6提取的多糖含量達到231mg/g，是水提取的1.83倍。