子宮切除術后陰道微生態的變化及其與外周血TLR2、TLR4表達和細胞免疫炎癥因子的關系

袁永興，高建建，逯蕾，胡茜，王靖

西安國際醫學中心醫院婦科一病區，陜西 西安 710100

陰道是由女性特殊解剖結構、陰道菌群、內分泌環境、局部免疫等組成的重要的微生態系統之一，其微生態穩態對維持陰道自凈作用、維護女性生殖健康具有重要意義[1]。對于子宮切除術患者而言，手術本身可直接損壞陰道微生態解剖結構，而術前、術后抗生素使用可殺滅陰道正常微生物，加之術后腹水經陰道殘端溢出、陰道積血或滲液排出不暢等原因，使得陰道酸性環境發生改變，這些均能導致陰道微生態嚴重破壞，繼而增加患者陰道感染風險，引發多種婦科疾病[2-3]。Toll 樣受體(TLR)是一類在機體固有免疫中扮演重要角色的模式識別受體，其信號通路異常表達對炎癥反應發生進展具有重要意義，被認為與感染性疾病關聯密切[4]。輔助性T 細胞(Th 細胞)在人體細胞免疫中起重要作用，可通過影響局部自然殺傷細胞活性、T淋巴細胞應答能力等影響女性生殖道清除病原體能力[5]。已有研究表明，陰道微生態變化與機體免疫功能可相互影響[6]。基于以上研究背景，本研究通過探究子宮切除術后患者陰道微生態變化與外周血Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)表達及細胞免疫炎癥因子的關系，旨在進一步加深對陰道微生態失衡機制的認識，從而為臨床針對性防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過方便抽樣法選取2021 年1~12 月西安國際醫學中心醫院收治的95 例行子宮切除術患者為研究對象。納入標準：(1)均為腹腔鏡下全子宮切除術患者；(2)術前1個月內無抗生素、微生態制劑、口服避孕藥使用；(3)術前3 個月內無糖皮質激素、免疫抑制劑等應用；(4)術前均使用甲硝唑行陰道準備，術后均連續使用抗菌藥物5~7 d；(5)精神正常。排除標準：(1)合并全身感染性疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、重要臟器功能不全者；(2)絕經期女性；(3)無法取得檢查、研究配合；(4)糖尿病患者；(5)精神病史。95 例患者年齡36~56 歲，平均(43.14±6.78)歲；體質量指數19.5~28.9 kg/m2，平均(23.68±3.15) kg/m2；原發疾?。鹤訉m肌瘤36 例，子宮腺肌癥28 例，功能性子宮出血15 例，重度宮頸病變10 例，重度子宮內膜病變6 例。本研究經醫院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 陰道微生態檢測及定義[7]于術前、術后1周，采用無菌長棉簽采集陰道側壁上1/3處陰道分泌物標本送檢，主要檢測內容：(1)陰道pH 值：采用精密pH 試紙直接測定陰道分泌物pH 值，pH 值≤4.5、>4.5分別視為正常、異常升高；(2)菌群密度：陰道分泌物涂片，干燥、固定，革蘭染色后于油鏡下(放大倍數10×100)觀察陰道菌群，各視野平均細菌數1~9 個、10~99 個、100個及以上(光鏡下細菌滿視野)、細菌聚集成團或將黏膜上皮細胞密集覆蓋分別分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級；(3)菌群多樣性：涂片中可辨別細菌1~3種、4~6種、7~9 種、10 種及以上分別分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級；(4)乳桿菌數量：計數以油鏡下各視野乳桿菌平均數為準，未見乳桿菌或僅1~5 個/Hp、6~15個/Hp、16~30個/Hp、>30 個/Hp 分別分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級。正常陰道微生態定義：陰道pH值3.8~4.5，陰道菌群密度Ⅱ級或Ⅲ級，菌群多樣性Ⅱ級或Ⅲ級，優勢菌為乳桿菌(即菌群中乳桿菌密度最大)。陰道微生態失衡：不符合上述正常定義中任意一條均視為微生態失衡。

1.2.2 TLR2、TLR4 表達 于術前、術后1 周，采集患者空腹靜脈血標本5 mL，以3 000 r/min、離心半徑10 cm 離心10 min，留取血清于-80℃下保存備用；采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，采用流式細胞術檢測TLR2、TLR4 在CD14+細胞表面表達百分率；熒光標記抗體FITC-抗人CD14 單抗、APC-抗人TLR2單抗、PE-抗人TLR4單抗均出自美國eBioscience 公司，檢測儀器為美國Beckman Coulter公司CytoFLEX LX型流式細胞儀。

1.2.3 細胞免疫炎癥因子 取上述血清標本解凍后，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測Th1、Th2細胞因子水平，主要包括白介素-2 (IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)，試劑盒均出自美國BioVision公司。

1.3 觀察指標 (1)對比患者手術前后陰道微生態變化，統計陰道微生態失衡率；(2)比較手術前后失衡組與正常組TLR2、TLR4 及細胞免疫炎癥因子表達；(3)分析術后陰道微生態與TLR2、TLR4 及細胞免疫炎癥因子相關性。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0 統計軟件分析數據。計數資料比較行χ2檢驗，等級資料行秩和檢驗；計量資料呈正態分布，均數±標準差(±s)表示，組間比較行獨立樣本t檢驗；采用Spearman 相關分析法分析陰道微生態與TLR2、TLR4 及細胞免疫炎癥因子的相關性；繪制受試者工作特征曲線(ROC)評估TLR2、TLR4及細胞免疫炎癥因子對陰道微生態失衡的預測價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者手術前后的陰道微生態比較 術后1周，患者的陰道pH 值、菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數量分級與術前比較差異均具有統計學意義(P<0.05)；術后陰道微生態失衡率73.68%，明顯高于術前的44.21%，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 95例患者手術前后的陰道微生態比較[例(%)]Table 1 Comparison of vaginal microecology in 95 patients before and after surgery[n(%)]

2.2 失衡組與正常組患者手術前后的TLR2、TLR4表達比較 術前，失衡組與正常組外周血TLR2、TLR4表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；術后1周，失衡組外周血TLR2、TLR4表達水平明顯高于術前及正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 失衡組與正常組患者的TLR2、TLR4表達水平比較(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

表2 失衡組與正常組患者的TLR2、TLR4表達水平比較(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

注：與本組術前比較，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.3 失衡組與正常組患者手術前后的細胞免疫炎癥因子比較 術前，失衡組與正常組患者的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；術后1周，失衡組患者的血清IL-2、TNF-α水平明顯高于術前及正常組，IL-4、IL-10水平明顯低于術前及正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 失衡組與正常組患者手術前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

表3 失衡組與正常組患者手術前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

注：與本組術前比較，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.4 術后陰道微生態與TLR2、TLR4及細胞免疫炎癥因子的相關性 經Spearman 相關分析法分析結果顯示，陰道pH 值與TLR4、IL-2、TNF-α表達呈正相關(P<0.05)；菌群密度、菌群多樣性與TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表達均呈正相關(P<0.05)，與IL-4、IL-10均呈負相關(P<0.05)；乳桿菌與TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表達呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 術后陰道微生態與TLR2、TLR4及細胞免疫炎癥因子的相關性(r值)Table 4 Correlation between postoperative vaginal microecology and TLR2,TLR4 and cellular immune inflammatory factors(r)

2.5 TLR2、TLR4 及炎癥因子對陰道微生態失衡的預測價值 以是否診斷陰道微生態失衡為狀態變量，以外周血TLR2、TLR4 表達水平及血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 水平為檢驗變量繪制ROC 曲線，結果顯示，TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 診斷陰道微生態失衡的ROC 曲線下面積分別為0.729、0.842、0.830、0.741、0.812、0.715 (P<0.05)。見圖1 和表5。

圖1 TLR2、TLR4及炎癥因子診斷陰道微生態失衡的ROCFigure 1 ROC of TLR2, TLR4 and inflammatory factors in the diagnosis of vaginal microecological imbalance

表5 TLR2、TLR4及炎癥因子對陰道微生態失衡的診斷效能Table 5 Diagnostic efficiency of TLR2,TLR4 and inflammatory factors on vaginal microecological imbalance

3 討論

3.1 子宮切除術后陰道微生態失衡率升高 本研究結果顯示，術后1 周，患者陰道pH 值>4.5 比例明顯升高，菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數量分級均下降，陰道微生態失衡率顯著高于術前，提示子宮切除術可加重陰道微生態破壞。分析原因，正常情況下，乳桿菌是陰道優勢菌群，可通過釋放大量乳酸維持陰道偏酸性環境，其pH 值一般不超過4.5[8]。除乳桿菌外，陰道正常菌群中還包括棒狀感覺、大腸桿菌、類桿菌、梭桿菌、腸球菌、加德納菌、表皮葡萄球菌等細菌，維持著一定的菌群密度和多樣性，不過其中95%左右為兼性和專性厭氧菌，這些細菌可通過自身黏附機制同陰道上皮細胞受體結合，并于陰道壁黏膜表面生長，這對參與宿主營養轉化、調節免疫力、抑制外來病原菌生長、維持生殖健康等具有重要意義[9]。對行子宮切除術患者而言，為降低圍生期感染風險，術前會行陰道擦洗換藥，術后會常規預防性使用抗生素，這會導致陰道乳桿菌數量減少甚至消失，而且術后早期活動下降、陰道滲出液或積血難以順利排出，可一定程度上中和陰道酸度，這些因素使得患者術后陰道pH無法維持在4.5以內；此外，手術創傷、麻醉刺激、術后免疫紊亂等等均不利于早期乳桿菌數量及菌群密度、多樣性恢復，因此本研究患者術后陰道pH值>4.5比例升高，而菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數量分級均下降，陰道失衡率大大升高。李辭妹等[10]研究顯示，全子宮切除術后患者乳桿菌數量、陰道pH 值、菌群多樣性、菌群密集度分級均明顯下降，而給予乳桿菌干預能促進陰道微生態恢復，這與本研究有相似之處。

3.2 陰道微生態失衡與TLR2、TLR4表達呈正相關 TLRs作為機體感知包括細菌、病毒、真菌等多種病原體入侵的膜受體家族，在機體固有免疫中扮演重要角色，由TLRs 介導的免疫炎癥反應與女性生殖系統多種炎癥性疾病關聯密切[11]，而陰道微生態在女性生殖系統相關疾病發生、進展全程中也起重要作用[12]，因此TLRs表達可能與女性陰道微生態有關。本文結果顯示，陰道微生態失衡組外周血TLR2、TLR4表達百分率較術前明顯升高，且高于正常組，提示TLR2、TLR4異常升高可能參與陰道微生態失衡發生。TLR2、TLR4是TLRs家族最具代表性成員，其中TLR2可識別的特異性配體最為廣泛，其外源性配體主要包括革蘭陽性菌及其細胞壁肽聚糖、脂磷壁酸等成分，TLR4是最早發現也是當前研究最多的TLR，其外源性配體主要為革蘭陰性菌脂多糖[13]。研究發現，孕婦微生態失衡率較正常育齡女性明顯升高，且孕婦陰道灌洗液TLR2 表達明顯高于正常育齡女性[14]；還有研究指出，血清TLR2 在宮頸癌繼發陰道感染者表達明顯升高，檢測其水平對陰道感染具有較高診斷價值[15]；上述研究也提示TLR2異常表達可能與女性陰道微生態失衡或陰道感染有關。文獻顯示[16]，無癥狀白假絲酵母菌攜帶者、有癥狀陰道念珠菌感染者內皮細胞TLR4 表達水平明顯高于健康受試者；還有報道認為，乳桿菌可通過下調TLR4 mRNA 和蛋白表達，降低陰道炎癥反應；上述研究均提示，TLR4 與陰道微生態變化有關[17]。故陰道微生態失衡組TLR2、TLR4 表達升高。本研究相關性分析顯示，陰道pH 值與TLR4、呈正相關，菌群密度、菌群多樣性與TLR2、TLR4均呈正相關，乳桿菌與TLR2、TLR4呈負相關，進一步證實子宮切除術后患者陰道微生態與TLRs 表達有關。此外，ROC曲線結果顯示，TLR2、TLR4診斷陰道微生態失衡的ROC曲線下面積分別為0.729、0.842，提示檢測TLR2、TLR4 對子宮切除術后患者陰道微生態失衡有一定預測價值。

3.3 陰道微生態與細胞免疫炎癥因子有相關性 Th1 細胞主要通過介導和刺激細胞免疫、細胞毒性T細胞等，參與對抗細胞內細菌及原蟲的免疫反應；Th2 細胞則主要介導B 細胞增殖抗體生成，刺激體液免疫，正常情況下，Th1/Th2 細胞處于動態平衡狀態，Th1/Th2 平衡失調與多種婦產科疾病有關[18]。IL-2、TNF-α是Th1 細胞的代表細胞因子，IL-4、IL-10 為Th2細胞的代表細胞因子，本文結果顯示，失衡組術后血清IL-2、TNF-α水平較術前及正常組顯著升高，而IL-4、IL-10 水平顯著降低，提示細胞免疫炎癥因子表達失衡可能與陰道微生態失衡有關。研究認為[19]，陰道微生態菌群可參與宿主細胞免疫、體液免疫形成，當陰道益生菌相對豐度下降、致病菌相對豐度升高時，陰道可出現Th1/Th2免疫平衡紊亂，使得陰道屏障功能減弱，進而增加陰道感染風險。行相關性分析發現，陰道pH值與IL-2、TNF-α呈正相關，菌群密度、菌群多樣性與IL-2、TNF-α表達均呈正相關，與IL-4、IL-10 均呈負相關，乳桿菌與IL-2、TNF-α呈負相關，進一步證實子宮切除術后患者陰道微生態與細胞免疫炎癥因子有關。林雪珊等[20]研究發現，先兆流產患者陰道微生態與Th1/Th2 細胞因子有關，與本研究相似。此外，本研究發現，IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10診斷陰道微生態失衡的ROC 曲線下面積分別為0.830、0.741、0.812、0.715，提示檢測細胞免疫炎癥因子對子宮切除術后患者陰道微生態失衡有一定預測價值。

結合本文結果可有以下提示：一，應重視子宮切除術后患者陰道微生態平衡評估和調節；二，TLR2、TLR4 表達及Th1/Th2 免疫失衡靶向調節或許在陰道微生態失衡改善乃至相關婦科炎癥疾病治療中有應用前景，當然這有待于更多研究給予證實。

綜上所述，子宮切除術后患者陰道pH、菌群密度、多樣性、乳桿菌等微生態均發生改變，陰道微生態失衡率升高，且與患者TLR2、TLR4 及細胞免疫炎癥因子表達有關。