通利樞機針刺法通過Notch通路對腦卒中后肢體痙攣大鼠肢體功能及神經功能的影響*

冉鵬飛，王艷敏，關曉蕾，張雅素

1.平頂山市第一人民醫院，河南 平頂山 467000； 2.平頂山市中醫醫院，河南 平頂山 467000； 3.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

流行病學研究顯示，全世界每年約有1 500萬新發腦卒中患者，而我國每年新發病例約150～200萬，且每年以9%的發病速度上升，約70%～80%腦卒中患者會遺留不同程度功能障礙[1]，其中以肢體痙攣最為常見，痙攣可阻礙機體運動功能重建，影響神經功能恢復，是腦卒中康復治療的重難點[2]。近年，中醫療法在腦卒中恢復中顯示出獨特治療價值，氣血逆亂、上犯于腦是其主要病機，而針刺可通過辨證取穴刺激促進腦損傷恢復，受到國內外學者認可[3-5]。中醫依據“少陽主樞”理論提出通利少陽樞機法防治中風相關性疾病，研究發現，其可提高患者活動能力與生活質量[6-7]。研究證明，Notch通路與神經損傷性疾病密切相關，可調控神經細胞分化、存活、凋亡等，在神經發育、再生中起決定作用[8]。基于此，本研究以Notch通路為切入點，探討通利樞機針刺法對腦卒中后肢體痙攣大鼠神經與肢體功能的改善作用及其機制，為腦卒中后肢體痙攣的治療提供實驗依據與理論基礎。

1 材料

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠80只，體質量 260～300 g，8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005，自由飲水攝食，滅菌型飼料適應性喂養1周，飼養溫度21～25 ℃，濕度30 %～33 %，每3日更換墊料1次，12 h晝夜循環照明，實驗操作符合平頂山市第一人民醫院動物倫理學批準，倫理批號：20200312。

1.2 藥品與試劑N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR，上海遠慕生物科技有限公司，貨號：YM-kk9079)；DAPT(γ-分泌酶抑制劑，分子式：C23H26F2N2O4，美國Sigma-Aldrich公司，貨號：D5942-5MG)；γ-氨基丁酸a型((γ-aminobutyricacid type A，GABAa)、γ-氨基丁酸轉運體(γ-aminobutyric acid transporter-1，GAT-1)、Notch1、Jagged1、β-actin抗體(美國Abcam公司，貨號：ab229678、ab177483、ab167441、ab85763、ab50599)。

1.3 儀器SLY-B型四道生理記錄儀(上海康為醫療科技發展有限公司)；DYCZ-40D型轉印電泳儀(武漢純度生物科技有限公司)；Q1600型實時熒光定量PCR儀(杭州柏恒科技有限公司)；GenoSens 1860型凝膠成像分析系統(上海臻諾生物科技有限公司)；HFJ-8(10)型內切式勻漿機(天津市恒奧科技發展有限公司)；一次性無菌針灸針(規格：0.25 mm×25.00 mm、0.25 mm×13.00 mm，河南澤垣醫療器械銷售有限公司)。

2 方法

2.1 分組、建模與干預80只大鼠適應性飼養1周后，取12只為對照組，12只為假手術組，其余56只大鼠采用Zea Longa線栓法與內囊注射NMDAR法建立腦卒中后肢體痙攣模型[9]，具體如下，建立腦卒中模型(Zea Longa線栓法)：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉成功后，將大鼠仰臥位綁縛于手術臺，備皮、消毒、鋪巾，于頸項部正中偏右做切口，鈍性分離右側頸總動脈、迷走神經，暴露頸總動脈分叉處、頸外動脈、頸內動脈，在頸總動脈遠心端、頸外動脈近心端使用6-0線結扎，動脈夾夾閉頸內動脈，阻斷血流；頸總動脈分叉(膨大5 mm)處剪“V”型切口，栓線插入頸內動脈，打開動脈夾，當進線約18～20 mm稍感阻力處停止插線，頸內動脈近心端及栓線一同結扎，縫合切口；術后常規抗感染、防腦水腫，單籠喂養，保證大鼠呼吸通暢。Zea Longa評分1～3分說明模型成功。建立肢體痙攣模型(內囊注射NMDAR法)：腦卒中模型建立后的第2天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后將內含5 μL NMDAR的微量注射器縛于腦立體定位儀上，消毒鋪巾后沿大鼠顱頂矢狀縫做切口(1.5～2 cm)，逐層分離皮膚組織等，暴露前囟，拉開局部組織以暴露右側額骨、頂骨交界骨縫，定位內囊位置(矢狀縫偏右側2.4 mm、前囟偏后1.4 mm)，記號筆標記，鉆孔，以破開顱骨為深度標準，微量注射器垂直插入(7 mm)，緩慢注射5 μL NMDAR(注射時間5 min)，拔出微量注射器，明膠海綿壓迫止血，消毒，縫合切口，改良版Ashworth量表評定1～4級表明模型成功。假手術大鼠僅分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，不結扎、不插線，內囊注射5 μL生理鹽水，其余同上。對照組大鼠不做任何處理。在造模過程中，5只大鼠因神經功能嚴重受損剔除，3只大鼠因血管破裂出血剔除，2只大鼠因呼吸道炎癥反應死亡剔除，將剩余46只造模成功大鼠分為模型組(n=11)、DAPT組(n=11)、針刺組(n=12)、針刺+DAPT組(n=12)。針刺組大鼠于術后第1天開始針刺治療，參照動物穴位結合人體同身寸取穴進行定位，左側天井穴直刺5 mm，左側正營穴平刺 5 mm，左側環跳穴直刺10 mm，留針15 min，留針期間，間隔5 min施展1次平補平瀉手法，每次 10 s，每日針刺1次，共持續2周；DAPT組大鼠以 0.1 mg·kg-1劑量進行腹腔注射，每日1次，持續2周；針刺+DAPT組干預手段同上述針刺組、DAPT組；假手術組、模型組大鼠在相同時間仰臥位固定于鼠板上，不進行針刺治療，腹腔注射生理鹽水，時間同上；對照組大鼠不捆綁、不治療。

2.2 神經功能評估干預2周結束后，采用Zea Longa評分評估各組大鼠神經功能，評分標準如下，0分：活動正常，無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展患側前爪，輕微神經功能受損；2分：向外側轉圈，中度神經受損；3分：向患側傾倒，重度神經受損；4分：無法自發行走，意識明顯下降或喪失；5分：死亡。

2.3 肢體功能檢查評估神經功能后采用Feeney平衡木評分[10]評價大鼠肢體功能，在距離地面高 10 cm 處放置長80 cm、寬2.5 cm的平衡木，觀察大鼠在平衡木上的狀態，評分如下，0分：能跳上平衡木，能行走，不跌倒；1分：能跳上平衡木，能行走，跌倒幾率<50%；2分：能跳上平衡木，可行走，跌倒幾率≥50%；3分：在健側后肢支持下可跳上平衡木，患側后肢無法讓大鼠移動；4分：可坐于平衡木上，但不能行走；5分：放在平衡木上會掉下來。

2.4 肌張力評估神經、行為評估結束后，使用電生理描記結果評估肌張力。各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉淺度全麻后，使用四道生理記錄儀測定大鼠肌張力，測定方法：一端點擊插入左后肢股四頭肌，另一端插入尾部，于左后肢下端系低順應性棉線，將棉線通過張力傳感器與生理記錄儀相連，定時刺激股四頭肌，刺激時間10 s，刺激量3 mA，據此產生的電信號反映肌張力變化，肌張力越低，刺激痙攣肢體被動運動幅度越大，描記電信號越高。

2.5 RT-PCR檢測Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA的表達水平上述檢測完成后處死大鼠，快速取出大鼠腦組織，置于凍存管，凍存管液氮降溫1 d，-80 ℃環境凍存，待測。RT-PCR操作步驟如下：①提取總RNA，加入裂解液，內切式勻漿機勻漿，溫育，添加氯仿、異丙醇、乙醇(體積分數75%)后離心，40 μL DEPC水溶解提取RNA；②cDAN合成，剔除總RNA中的DNA、DNase 1，反轉錄cDNA；③擴增，PCR反應程序為95 ℃預變性 60 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸、采集熒光30 s，共進行40個循環；④以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法評估PCR產物的表達水平。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot測定Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1的蛋白表達水平研磨大鼠腦組織，加入裂解液，勻漿至裂解充分，4 ℃ 15 000 r·min-1離心15 min，取酶標板，依次添加試劑，各孔加入BCA工作液，振蕩30 s，562 nm下測吸光度，繪制標準曲線，完成蛋白定量；制備SDS-PAGE膠，取樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳分離后轉膜至PVDF膜，轉膜時間2 h，電流380 mA，TBST配置5 %脫脂牛奶，封閉1 h，加一抗(稀釋比例12 000)4 ℃孵育過夜，第二日復溫，TBST液漂洗3次，每次 10 min，加二抗(稀釋比例15 000)常溫孵育1 h，漂洗3次，β-actin為內參，顯影定影，采用凝膠圖像處理分析系統對蛋白條帶灰度值進行處理統計。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能比較對照組、假手術組大鼠Zea Longa評分為0，神經功能正常。與對照組、假手術組比較，模型組及DAPT組大鼠Zea Longa評分顯著升高(P<0.05)；與模型組、DAPT組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠Zea Longa評分顯著降低(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠Zea Longa評分顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠神經功能評分比較 分)

3.2 各組大鼠肢體功能與肌張力比較對照組、假手術組大鼠肢體功能與肌張力正常。與對照組、假手術組比較，模型組及DAPT組大鼠Feeney平衡木評分顯著升高(P<0.05)；與模型組、DAPT組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠Feeney平衡木評分顯著降低(P<0.05)，電生理描記結果顯著升高(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠Feeney平衡木評分顯著升高(P<0.05)，電生理描記結果顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肢體功能與肌張力水平比較

3.3 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA表達水平比較與對照組、假手術組比較，模型組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，GAT-1mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠腦Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達水平降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1 mRNA表達水平比較

3.4 各組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表達水平比較與對照組、假手術組比較，模型組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，GAT-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，GAT-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達水平顯著降低，GAT-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表達水平比較

注：A：對照組；B：假手術組；C：模型組；D：DAPT組；E：針刺組；F：針刺+DAPT組圖1 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白條帶圖

4 討論

現代醫學研究發現，腦卒中后肢體痙攣本質是腦卒中發病后高級中樞受損，引起下位中樞運動神經元抑制或減弱，干擾大腦下位中樞調控，脊髓前角運動神經元因神經遞質易化作用興奮性增高，出現肢體痙攣，以肢體活動受限、攣縮變形等為主要表現，嚴重降低生活質量[11-12]。改善腦卒中患者神經功能、糾正異常肢體功能障礙，是腦卒中后恢復的首要目標[13-15]。

國內外研究學者證實[16-18]，針刺療法在腦卒中及腦卒中后功能障礙性疾病中均取得確切效果。中醫認為，機體內部陽氣于表里之間，如樞機一般，可入可出，升降出入自如，則樞機氣血運行通順，陰陽協調，開闔有度[19-20]；而三焦統領五臟六腑、經絡、榮衛之氣，三焦通則樞機通、氣血經絡通，手少陽三焦經疏風行氣、開竅解郁，足少陽膽經疏肝利膽通竅，故手足少陽經脈對樞機運行順暢、全身經絡協調有關鍵作用[21-22]。本研究成功構建腦卒中后肢體痙攣大鼠模型發現，模型組、DAPT組大鼠Zea Longa評分升高，表明腦卒中大鼠神經功能嚴重受損，選取手少陽三焦經“天井”穴與足少陽膽經“正營”“環跳”穴位合用，予以通利樞機針刺法干預后，大鼠Zea Longa評分顯著降低，提示通利樞機針刺法能促進大鼠神經功能恢復，取少陽經穴可調節陰陽消長，宣利上焦，通利下焦，使樞機正常運轉，腦神得正，有效疏導神經，促進興奮性神經遞質釋放，進而改善大鼠神經功能。腦卒中后肢體痙攣大鼠肌張力明顯升高，運動功能受損，本研究顯示，模型組、DAPT組大鼠Feeney平衡木評分提高，電生理描記結果降低，提示腦卒中后肢體痙攣大鼠肢體功能異常，而予以通利樞機針刺法干預后，針刺組大鼠Feeney平衡木評分明顯降低，電生理描記結果明顯升高，說明通利樞機針刺法在提高大鼠肢體功能方面效果顯著，針刺“天井”“正營”“環跳”穴，切入腦脈痹阻病機，可引病邪由重轉輕，氣機開闔有度，氣血陰陽交通無礙，樞機通暢，四肢筋骨得以舒展，臟腑功能得以恢復，共奏樞機通利之功，從而降低大鼠肌張力，提高運動功能，促使大鼠肢體功能得到有效恢復。

國外學者廣泛研究Notch信號通路在神經系統發育中的作用，認為Notch通路在神經元、神經膠質細胞中表達，與諸多神經系統疾病有關，了解潛在機制或可為疾病治療提供新見解[23-24]。Notch通路由Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Jagged1-2、Delta-like1、3、4)、DNA結合蛋白、Notch調節分子等組成，作為一個多維基因調控網絡系統，其調節功能多樣，現有研究表明，其在神經元凋亡、神經干細胞分化等方面具有重要的調控作用[25-27]。謝莉娜[28]研究發現，電針可促進腦卒中肢體痙攣大鼠海馬區突觸可塑性相關蛋白、GABAa受體等表達，以緩解肢體痙攣狀態。雖已知曉腦卒中后肢體痙攣與神經再生密切相關，但具體作用機制尚缺乏研究支持，本研究為明確Notch通路與腦卒中后肢體痙攣狀態的關系，分組干預后發現，模型組、DAPT組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、GABAamRNA與蛋白表達水平降低，GAT-1mRNA與蛋白表達水平升高，提示Notch通路參與腦卒中后肢體痙攣發展過程；使用通利樞機針刺法治療后，Notch1、Jagged1、GABAamRNA與蛋白表達水平升高，GAT-1mRNA與蛋白表達水平降低，提示通利樞機針刺法可能參與促進Notch通路表達的作用，以通暢氣血經絡；在應用通利樞機針刺法治療同時，還使用Notch信號通路抑制劑DAPT，結果發現，針刺組大鼠腦Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達水平高于針刺+DAPT組，GAT-1蛋白表達低于針刺+DAPT組，證實通利樞機針刺法可發揮調節樞機、通暢氣血的作用，以促進Notch通路、GABAa受體蛋白表達，降低GAT-1蛋白表達，進而促進神經元突觸傳遞，利于神經元再生，改善大鼠神經與肢體功能。

綜上，通利樞機針刺法可改善腦卒中后肢體痙攣大鼠的神經功能、肢體功能，作用機制可能與調控Notch通路相關蛋白表達有關，為臨床腦卒中后肢體痙攣治療提供實驗與理論依據。