芹菜素對Aβ1-42致阿爾茨海默病大鼠海馬組織氧化應激和炎癥反應的影響*

范紅娟，康凱寧，栗志英

1.邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056000； 2.河北工程大學附屬醫院，河北 邯鄲 056000

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人群中較為常見的一種中樞神經系統退行性疾病，是老年癡呆的主要分型，其致死率僅次于心血管疾病、腫瘤、腦卒中，嚴重影響老年人生活質量和生命健康。AD主要表現為認知障礙、記憶力減退、人格及行為改變等[1]。海馬組織是與認知、記憶等密切相關的腦功能區，研究發現，減輕海馬神經元損傷能夠有效改善AD癥狀并延緩其進展[2-3]。近年來病理學研究發現，β淀粉樣蛋白(beta amyloid，Aβ)病理性沉積是AD最主要的病理改變，氧化應激和炎癥反應在其病變過程中發揮著重要作用[4-5]。因此，探索以抑制氧化應激和炎癥反應為治療靶點的新型藥物對改善AD具有重要意義。

AD在中醫中又稱為“老年呆病”，屬于“健忘”“呆癥”“文癡”等范疇，其病機在于脾胃虛弱、氣血虧虛、痰濁血淤、阻塞清竅，為本虛標實之證[6-7]。芹菜具有養血補虛、清熱解毒等功效，芹菜素是天然存在于旱芹等植物中的一種黃酮類化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[8-9]。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1(nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是氧化應激反應重要的信號通路[10]；核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)對炎癥反應具有重要調控作用[11]。研究發現，芹菜素可調控Nrf2/HO-1通路抑制氧化應激進而有效減輕妊娠期糖尿病大鼠肝損傷，調控NF-κB核轉位抑制炎癥反應進而有效抑制糖尿病腎損傷[12-13]。本實驗旨在探討芹菜素對β-淀粉樣蛋白1～42片段(β-amyloid 1～42 fragments，Aβ1-42)致AD大鼠海馬組織氧化應激和炎癥反應的影響及相關機制。

1 材料

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性Wistar大鼠100只，體質量220～250 g，購自河北醫科大學實驗動物公共服務平臺，許可證號：SYXK(冀)2020-001，動物合格證號：20200925006。大鼠分籠飼養于室溫23～25 ℃、相對濕度55%～65%的環境中，自由飲水進食，所有大鼠在實驗過程中均按照3R原則給予人道主義關懷。本實驗通過邯鄲市中心醫院倫理委員會審批，審批號：HDZXLL(K)2020-024。

1.2 藥物與試劑芹菜素(陜西慧科植物開發有限公司，純度≥98%，批號：191125)；吡拉西坦片(石藥集團歐意藥業有限公司，批號：1200413)。Aβ1-42凍干粉(美國Sigma公司，批號：119M8714V)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：200127、200319、200114、200407、191230、200319)；胞漿胞核蛋白制備試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號：0918A20)；Nrf2抗體、HO-1抗體、NF-κB p65抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-1074R、bs-23397R、bs-3485R)；β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abclonal公司，批號：AC026)；IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：180511)；增強型化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0018AS)。

1.3 儀器MD-3000型動物腦立體定位注射儀(美國BAS公司)；ZH-Morris型水迷宮及視頻分析系統(安徽正華生物儀器設備有限公司)；RM2016型石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司)；BMJ-A型包埋機(常州中威電子儀器有限公司)；5424R型離心機(德國Eppendorf公司)；MK3 型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；JY200C型轉膜儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；GelDoc XR型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥適應性飼養1周后，按照隨機數字表法，將100只大鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組、芹菜素低劑量組、芹菜素高劑量組和吡拉西坦組，每組20只。除正常組外，其他組大鼠均參照文獻[14]報道的方法復制AD大鼠模型，具體如下：以3 mL·kg-1體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位注射儀，于前囟后3.0 mm、正中矢狀縫左旁和右旁3.0 mm、顱骨表面下3.5 mm處分別緩慢注射 2.5 μL 的Aβ1-42溶液(濃度4 g·L-1)，注射時間 10 min；正常組大鼠緩慢注射2.5 μL 9 g·L-1氯化鈉溶液，注射時間10 min。造模完成后，芹菜素低劑量組、芹菜素高劑量組大鼠分別以20 mg·kg-1、40 mg·kg-1劑量腹腔注射芹菜素溶液[15]，吡拉西坦組大鼠以700 mg·kg-1劑量腹腔注射吡拉西坦溶液(根據人臨床劑量換算)，正常組和模型組大鼠腹腔注射給予9 ng·L-1氯化鈉溶液，注射體積均為5 mL·kg-1，每天1次，療程28 d。

2.2 Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力將Morris水迷宮分為4個象限，平臺固定于第4象限的中心位置，水溫25 ℃。末次給藥24 h后，各組隨機取10只大鼠，適應性訓練3 d，每天訓練4次，分別從4個象限頭朝器壁方向將大鼠放入水中并引導大鼠尋找第4象限的平臺。定位航行實驗：第4天將大鼠分別從4個象限頭朝器壁方向放入水中，記錄找到位于第4象限平臺的時間(120 s內未找到則按120 s計算)，即為逃避潛伏期；空間探索實驗：第5天撤掉位于第4象限的平臺，將大鼠從第2象限頭朝器壁方向放入水中，記錄120 s內穿越第4象限原平臺位置的次數。

2.3 HE染色觀察海馬組織CA1區神經元病理改變及病理分級Morris水迷宮實驗完成后，麻醉、頸椎脫臼處死大鼠，取腦組織并去除小腦、腦干、嗅球后置于10%中性甲醛溶液中固定3 d，石蠟浸潤包埋，5 μm厚連續切片，部分切片經梯度乙醇脫蠟水化后行常規HE染色，通過光學顯微鏡觀察海馬組織CA1區病理特點。參照文獻[16]報道的方法對海馬組織CA1區病理改變進行分級：神經元形態和結構正常為“-”；少量神經元形態改變為“+”；部分神經元胞核固縮或溶解、神經元排列疏松為“++”；大部分神經元胞核固縮或溶解、神經元層次紊亂為“+++”。

2.4 海馬組織SOD、GSH-Px活性，MDA含量及TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測分別取各組剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，冰上取腦組織并剝取海馬體，取左側海馬組織，剪碎后加入6倍量4 ℃裂解液研磨勻漿，4 ℃、2 000 r·min-1離心 5 min，離心半徑10 cm，取上清液，按照試劑盒說明檢測SOD、GSH-Px活性，MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

2.5 Western Blot檢測海馬組織Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達水平取右側海馬組織100 mg，按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒操作說明制備胞漿胞核蛋白，BCA法測定總蛋白含量后經SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，50 g·L-1脫脂奶粉封閉處理后，滴加Nrf2抗體(稀釋比例1500)、HO-1抗體(稀釋比例1500)、NF-κB p65(稀釋比例1800)、β-actin抗體(稀釋比例11 000)，4 ℃ 孵育過夜，滴加IgG二抗(稀釋比例 12 000)室溫孵育2 h，滴加ECL顯影后通過Image J 軟件計算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 芹菜素對AD大鼠認知功能的影響與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)，穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數顯著增多(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數顯著增多(P<0.05)。見表1。

3.2 芹菜素對AD大鼠海馬組織CA1區神經元病理改變及病理分級的影響正常組大鼠海馬組織CA1區神經元形態呈圓形或橢圓形，排列整齊，層次清晰。模型組大鼠海馬組織CA1區神經元數量減少，形態不規則，排列紊亂，胞體固縮深染。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬組織CA1區神經元病理學改變呈不同程度減輕，芹菜素高劑量組改善效果最為顯著。與正常組比較，模型組病理分級顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組病理分級顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組病理分級顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 芹菜素對AD大鼠認知功能的影響

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組：E：吡拉西坦組圖1 芹菜素對AD大鼠海馬組織CA1區神經元病理改變的影響(HE，×400)

表2 芹菜素對AD大鼠海馬組織CA1區神經元病理分級的影響

3.3 芹菜素對AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響與正常組比較，模型組海馬組織SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表3。

3.4 芹菜素對AD大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響與正常組比較，模型組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組 TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表3 芹菜素對AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

表4 芹菜素對AD大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

3.5 芹菜素對AD大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖2、表5。

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組；E：吡拉西坦組圖2 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白條帶圖

3.6 芹菜素對AD大鼠海馬組織胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組海馬組織胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達量比值均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達量比值均顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達量比值均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表6。

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組；E：吡拉西坦組圖3 大鼠海馬組織胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白條帶圖

表5 芹菜素對AD大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響

表6 芹菜素對AD大鼠海馬組織胞漿、胞核中NF-κB p65蛋白表達水平及比值的影響

4 討論

AD患病人群主要為65歲以上老年人，隨著我國人口老齡化的加劇，AD發病率呈明顯上升趨勢，已成為我國亟待解決的社會問題和醫學難題[17]。中醫藥具有防治結合、標本兼治的優勢，在慢性病防治方面得到廣泛關注與認可。芹菜為一年或二年生傘形科植物，其根、莖、葉、籽均可入藥，具有養血補虛、清熱解毒、防癌抗癌之功效，具有較高的藥用價值。芹菜素為芹菜的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等多種藥理學作用，涂豐霞等[15]研究發現，芹菜素對腦缺血所致認知功能障礙具有明顯改善作用。吡拉西坦是一種神經細胞保護劑，對AD所致認知障礙、思維功能減退等具有明顯改善作用，常用做AD新型藥物實驗研究的陽性對照藥物[18]。雙側海馬定向注射Aβ1-42制備AD大鼠模型具有操作簡單、重復率高、與人類AD病理特點近似等優勢，是國內外普遍認可的造模方法。本研究發現，AD模型大鼠學習記憶能力下降，大腦海馬組織CA1區呈現神經元數量減少、形態不規則、排列紊亂、胞體固縮深染等病變，與李喜香等[19]研究報道一致，經芹菜素治療則能夠明顯提高AD大鼠學習記憶能力，改善海馬組織CA1區病變、降低病理分級，并且芹菜素高劑量組效果優于吡拉西坦組，提示芹菜素能夠減輕AD大鼠海馬組織損傷，改善AD癥狀。

Li等[20]研究發現，Aβ病理性沉積可導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，SOD、GSH-Px等抗氧化酶過度消耗，不能及時清除的ROS將攻擊生物膜和生物大分子引發氧化應激損傷并誘發細胞凋亡。此外，Aβ病理性沉積將誘發炎癥因子大量釋放而引起炎癥反應，其中具有趨化因子屬性的TNF-α、IL-1β、IL-6能夠刺激粒細胞等進一步釋放炎癥因子而加重炎癥反應[21]。Nrf2普遍存在于真核細胞中，能夠誘導SOD、GSH-Px等抗氧化酶表達而抑制氧化應激，并且Nrf2能夠調控其下游基因HO-1的轉錄與表達，而HO-1則能夠催化血紅素分解成亞鐵、一氧化碳、膽綠素，而膽綠素對ROS具有較強的還原活性，從而降低氧化應激損傷[22]。王珊等[23]研究發現，通過藥物激活Nrf2/HO-1通路能夠減輕Aβ致AD大鼠海馬組織氧化應激損傷。NF-κB是一種以p50/p65二聚體形式存在的核轉錄因子，生理狀態下與特異性酶抑制劑結合而無生理活性；病理狀態下，ROS等將誘導 NF-κB 與酶抑制劑解離而使其活化，核轉位后p65亞基與DNA特異性位點結合誘導炎性因子表達與釋放，進而加重炎癥反應[24]。HO-1則能夠抑制NF-κB活化與核轉位，從而間接抑制機體炎癥反應[25]。王海英等[26]研究發現，通過藥物抑制 NF-κB活化和核轉位能夠減輕AD所致炎癥反應。本研究發現，經芹菜素治療能夠明顯提高AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高Nrf2、HO-1蛋白表達量，降低胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達量的比值，芹菜素高劑量組作用優于吡拉西坦組，提示芹菜素具有抑制AD大鼠海馬組織氧化應激和炎癥反應的作用，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉位有關。

綜上所述，芹菜素能夠抑制Aβ1-42致AD大鼠海馬組織氧化應激和炎癥反應，改善AD癥狀，該作用可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉位有關。本研究結果為芹菜素治療AD提供參考，為AD藥物開發提供理論依據。