半枝蓮乙醇提取物對高低轉移性肝細胞癌細胞生長和侵襲的影響*

王倩，陳亭亭，王守梅，張樹輝

上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437

原發性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位致死腫瘤，嚴重威脅人民的生命安全和健康，其中75%～85%原發性肝癌為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，常由慢性乙型或丙型肝炎病毒感染所致[1]。大多數HCC在中晚期才被確診，選擇合理和規范化的多學科綜合治療可獲得最佳療效[2]。肝癌以氣血虧虛為本，肝失疏泄為基本病機，氣血濕熱瘀毒互結為標，蘊結于肝，漸成癥積，HCC不同病期分別采用疏肝理氣、活血化瘀、清熱解毒等扶正祛邪、標本兼治的辨證論治法恢復肝主疏泄之功能，使氣血流暢，祛濕熱瘀毒之邪，對控制癥狀、提高免疫力、預防復發轉移及提高生存質量等優勢明顯。以往研究顯示，清熱解毒藥半枝蓮在原發性肝癌的治療中使用頻率較高[3-5]。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮的全草，具有清熱解毒、散腫消癰等功效。藥理學及臨床研究表明，半枝蓮及其活性成分具有良好的抗腫瘤作用，常用于肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌等惡性腫瘤的治療[6-9]。本研究采用高、低轉移性HCC細胞系MHCC-97H和MHCC-97L探究半枝蓮乙醇提取物對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，并分析其作用機制。

1 材料

1.1 動物及細胞株SPF級4周齡雄性BALB/c裸鼠16只，體質量18～20 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：20180003007216。所有小鼠均飼養于恒溫(25±2) ℃，濕度50%～ 60%的SPF環境中，高壓滅菌后的水和飼料隨意進食。所有實驗方案均按照實驗動物治療和使用委員會的指南進行，并獲得上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院倫理委員會批準，倫理批準號：YYLAC-2019-036-4-2。人高、低轉移性HCC細胞株MHCC-97H和MHCC-97L購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 試劑半枝蓮(產地：浙江，上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥劑科，貨號：0306901)；5-氟尿嘧啶(美國MCE公司，貨號：HY-90006，規格：1 g/瓶)；DMEM高糖型培養基(美國Hyclone公司，貨號：SH30243.01)；胎牛血清(美國GIBCO公司，貨號：16000-044)；青鏈霉素混合液、結晶紫、RNase A(北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1400-100、C8470、R8020-25)；CCK-8 試劑盒(美國Signalway Antibody公司，貨號：CP002)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：PICPI23223)；PI染液(上海七海復泰生物科技有限公司，貨號：C001-200)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C1063)；CD133、EpCAM抗體(美國Invitrogen公司，貨號：11-1339-42、A15782)；CycinD1、P27抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：2922、3686)；Bcl-2、Bax、Ki-67抗體(英國Abcam公司，貨號：Ab194583、Ab32503、Ab209897)；E-cadherin、GAPDH抗體(美國Proteintech公司，貨號：20874-1-AP、60004-1-Ig)；Vimentin抗體(英國Affinity公司，貨號：AF0292)；二抗(上海譽源有限公司，貨號：70678)。

1.3 儀器精密電子天平(德國Sartorius公司，型號：CP225D)；高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：TDZ4-WS)；CO2恒溫培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：Thermo Forma 3111)；酶標分析儀(北京普朗新公司，型號：DNM-9602)；顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司，型號：XDS-500C)；Transwell小室(美國COSTAR公司，型號：3422)；流式細胞儀(美國BD公司，型號：Accuri C6)；凝膠成像系統(上海天能生命科學有限公司，型號：5200)；Leica石蠟切片機、全自動免疫組織化學儀(德國Leica公司，型號：RM2235、Bond Max)。

2 方法

2.1 藥物的制備參考文獻[10]介紹的方法制備半枝蓮乙醇提取物，取半枝蓮1 000 g，按1 g10 mL 的固液比加入體積分數70%乙醇，加熱回流提取3次，過濾后合并濾液，60 ℃真空干燥3 d，最后減壓濃縮得到粉末，將得到的粉末制成濃度為100 g·L-1的半枝蓮乙醇提取物儲備液，4 ℃冰箱備用。

2.2 細胞培養人高、低轉移性HCC細胞株MHCC-97H和MHCC-97L復蘇后置于含 100 U·mL-1青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM培養基中，5% CO2、37 ℃的培養箱中傳代培養。

2.3 CCK-8實驗取MHCC-97H和MHCC-97L細胞，制成3×104mL-1的細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔100 μL，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養過夜，每孔加入100 μL不同濃度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、2.0 g·L-1和3.0 g·L-1)的半枝蓮乙醇提取物，對照組加入等體積完全培養液，每組3個復孔，分別處理0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后棄培養液，每孔加入100 μL含10%CCK-8溶液的無血清必需培養基，5%CO2、37 ℃培養箱中孵育1 h后，采用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值(optical density，OD)，計算細胞生長抑制率。以50%最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)作為半枝蓮乙醇提取物組的實驗濃度進行后續實驗。根據實驗設計，后續實驗設對照組、半枝蓮乙醇提取物組和5-氟尿嘧啶組(10 mg·L-1)。

細胞生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

2.4 平板克隆實驗取MHCC-97H和MHCC-97L細胞，制成3×103mL-1的單細胞懸液，接種于37 ℃培養皿中，每皿1 mL，培養24 h。按照2.3項所述進行分組及給藥，每組3個復孔，5% CO2、37 ℃ 培養箱中繼續培養2周，每隔3 d換液1次并觀察細胞狀態，克隆完成后，PBS洗滌2次，4%甲醛固定15 min，加1%結晶紫染色30 min，流水沖洗、干燥，顯微鏡下觀察并按文獻介紹的方法計算細胞克隆形成率[11]。

2.5 細胞周期和凋亡實驗取MHCC-97H和MHCC-97L細胞，制成3×105mL-1的單細胞懸液，分別接種在6孔板中，每孔1 mL，培養24 h。按照2.3項所述進行分組及給藥，每組3個復孔，繼續培養72 h后。細胞周期實驗：胰酶消化細胞，離心 5 min 后，PBS洗滌2次，加入-20 ℃預冷的無水乙醇700 μL，于4 ℃固定24 h，繼續離心5 min，PBS重懸細胞，加入濃度為100 mg·L-1的RNase A溶液 100 μL，重懸沉淀細胞，避光下37 ℃溫浴30 min，每管加入濃度為50 mg·L-1的PI溶液400 μL，避光下4 ℃孵育10 min，進行流式細胞術檢測和分析。細胞凋亡實驗：胰酶消化細胞，離心5 min后PBS洗滌2次，計數10×104個重懸細胞，離心5 min，棄上清，分別加入195 μL Annexin V和5 μL FITC結合液混勻，避光下4 ℃孵育15 min；再加入PI染色液 5 μL 混勻，避光下4 ℃孵育5 min，進行流式細胞術檢測和分析。

2.6 細胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實驗根據文獻[12]記載的方法進行實驗。細胞劃痕實驗：取對數生長期MHCC-97H和MHCC-97L細胞，胰酶消化后計數8×105個細胞接種于培養皿中，細胞分組同2.3項所述，培養24 h后棄培養液，用槍頭劃去皿中細胞，PBS沖洗，按實驗分組給藥處理后，置于37 ℃培養箱中培養24 h。分別在劃痕0 h、24 h取出培養皿，在倒置顯微鏡下拍照，使用Image J軟件測量劃痕面積和寬度，計算細胞遷移率。細胞Transwell小室遷移和侵襲實驗：先將MHCC-97H和MHCC-97L細胞進行血清饑餓培養24 h，在各組Transwell小室的上室中加入細胞密度為2×105mL-1的細胞懸液0.3 mL(侵襲實驗另需在小室的上室中加入80 μL基質膠)，分組同2.3項所述，對照組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含10%FBS的完全培養液；半枝蓮乙醇提取物組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含2 g·L-1半枝蓮乙醇提取物和10%FBS的完全培養液；5-氟尿嘧啶組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含 10 mg·L-15-氟尿嘧啶和10%FBS的完全培養液，37 ℃培養72 h后甲醛固定，結晶紫染色后PBS洗滌，晾干，顯微鏡下計數遷移細胞數和侵襲細胞數。

細胞遷移率=(1-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%

2.7 細胞成球實驗取MHCC-97H和MHCC-97L細胞，制成1×104mL-1的細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔100 μL，每組3個復孔，按2.3項所述進行分組給藥后，用無血清成球培養基培養 14 d，期間每隔3 d換液1次，觀察細胞成球狀態，并計算球體形成率。

球體形成率=(成球細胞數/接種細胞數)×100%

2.8 干細胞標記EpCAM+和CD133+細胞比例檢測取MHCC-97H和MHCC-97L細胞，按2.3項所述進行實驗分組給藥后計數(5～10)×104個重懸細胞，加入200 μL PBS、5 μL EpCAM和5 μL CD133抗體混勻，4 ℃避光30 min，隨即進行流式細胞儀檢測并分析結果。

2.9 Western Blot檢測按2.3項所述進行實驗分組給藥后，參考文獻的方法提取MHCC-97H和MHCC-97L細胞蛋白質[11]，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，制備PAGE膠、上樣和電泳、轉膜，用5%脫脂奶粉封閉，加一抗CyclinD1、P27、Bcl-2、Vimentin、Ki-67(稀釋比例為11 000)、Bax(稀釋比例12 000)、E-cadherin(稀釋比例15 000)、GAPDH(稀釋比例18 000))和膜4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(稀釋比例110 000)與膜37 ℃孵育1 h，洗膜后加入配制的ECL發光液，放入凝膠成像系統檢測蛋白表達，再用灰度分析軟件進行結果分析。

2.10 裸鼠成瘤實驗將16只BALB/C裸鼠分為半枝蓮乙醇提取物組和對照組，每組8只。在每只裸鼠左側腋窩皮下注射100 μL(約2×106個)MHCC-97H細胞，SPF級條件下喂養，按文獻介紹的方法[11]，每日觀察裸鼠及移植瘤情況，待移植瘤直徑>0.5 cm時開始給藥治療，給藥劑量參考文獻[9]，半枝蓮乙醇提取物組灌胃給予0.97 g·kg-1的半枝蓮乙醇提取物溶液，對照組每天灌胃給予2.0 mL的9 g·L-1生理鹽水，隔5 d記錄移植瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算移植瘤的體積(體積=1/2×a×b2)[9]。灌胃35 d后處死裸鼠，取出腫瘤、肝和肺組織置于10%中性甲醛液固定。

2.11 形態學和免疫組織化學檢查將移植瘤、肝和肺組織進行取材，常規石蠟包埋，3～5 μm厚石蠟切片行HE染色和Ki-67免疫組織化學染色。免疫組化染色在全自動免疫組織化學儀中進行。顯微鏡下進行形態學觀察，免疫組織化學染色結果判讀參考文獻進行[13]。

3 結果

3.1 不同濃度半枝蓮乙醇提取物對肝癌細胞增殖和克隆形成的影響與對照組比較，不同濃度半枝蓮乙醇提取物可明顯抑制MHCC-97H和MHCC-97L細胞的增殖，且呈劑量-時間依賴性(P<0.05)，見圖1A，其中半枝蓮乙醇提取物作用72 h的抑制作用最明顯，通過SPSS軟件分析顯示半枝蓮乙醇提取物組干預MHCC-97H和MHCC-97L細胞 72 h 的IC50值分別為 2.490 g·L-1及2.243 g·L-1，見圖1B，后續實驗選取2.0 g·L-1為半枝蓮乙醇提取物組藥物濃度。與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物可使MHCC-97H和MHCC-97L細胞的克隆數目明顯減少(P<0.01)，見圖1C。

注：A：細胞生長曲線；B：細胞抑制率；C：細胞平板克隆形成。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖1 不同濃度半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H和MHCC-97L細胞生長的影響

3.2 半枝蓮乙醇提取物對細胞周期和細胞凋亡的影響與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組 MHCC-97H和MHCC-97L細胞中G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.01)，S期和G2/M 期細胞比例顯著減少(P<0.01)，表明半枝蓮乙醇提取物將細胞周期停滯于G0/G1期。此外，與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物顯著促進MHCC-97H和MHCC-97L細胞凋亡(P<0.01)，見圖2。

注：A：細胞周期流式檢測圖；B：細胞周期分布比較；C：左側為細胞凋亡流式檢測圖，右側為細胞凋亡指數比較；與對照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖2 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H和MHCC-97L細胞周期和凋亡的影響

3.3 半枝蓮乙醇提取物對細胞劃痕愈合、遷移和侵襲的影響與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細胞的劃痕愈合進程明顯縮短(P<0.05)，細胞侵襲的數目明顯減少(P<0.05)；MHCC-97L細胞遷移數目明顯減少(P<0.05)。見圖3。

注：A：細胞劃痕試驗；B：細胞遷移實驗；C：細胞侵襲試驗。左側為光鏡下觀察得到的圖片(×200)，右側為計數資料比較；與對照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖3 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H和MHCC-97L細胞劃痕、遷移和侵襲的影響

3.4 半枝蓮乙醇提取物對細胞成球和干細胞特性的影響與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細胞成球體積明顯變小，細胞球體形成率明顯降低(P<0.01)，見圖4A。流式細胞術分析顯示，與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組EpCAM+與CD133+細胞比例顯著下降(P<0.01)，見圖4B。

注：A：細胞成球情況(×200)；B：干性標記EpCAM+和CD133+流式細胞術分布圖；左側為代表性圖片，右側為計數資料比較。與對照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖4 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H和MHCC-97L細胞成球和干細胞特性的影響

3.5 半枝蓮乙醇提取物對細胞周期、凋亡及上皮間質轉化相關蛋白表達的影響與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細胞周期和凋亡相關蛋白Cyclin D1、Bcl-2、Ki-67表達水平明顯降低(P<0.05)，P27、Bax表達水平明顯上調(P<0.05)；上皮間質轉化相關蛋白E-cadherin表達水平明顯上調(P<0.05)，Vimentin表達水平明顯下調(P<0.05)。見圖5。

注：A：Western Blot蛋白條帶圖片；B：蛋白表達定量分析。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=3圖5 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H和MHCC-97L細胞周期、凋亡及上皮間質轉化相關蛋白表達水平的影響

3.6 半枝蓮乙醇提取物對裸鼠移植瘤生長及肝、肺轉移的影響與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H細胞移植瘤體積明顯縮小(P<0.05)。見圖6A。移植瘤組織形態學檢查顯示，對照組腫瘤細胞呈彌散致密排列、有不同程度有絲分裂活性；半枝蓮乙醇提取物組腫瘤組織可見明顯的壞死和凋亡。見圖6B。免疫組織化學分析表明，與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組Ki-67蛋白染色減少，見圖6C。肝、肺組織形態學檢查顯示，與對照組比較，半枝蓮乙醇提取物組移植瘤肝、肺轉移灶的大小和數目明顯降低(P<0.05)。見表1，圖7。

注：A：移植瘤的大體形態和生長曲線；B：移植瘤組織形態學(HE染色，×200)；C：移植瘤Ki-67免疫組化染色(×400)。與對照組比較，*P<0.05；n=8圖6 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H細胞裸鼠移植瘤生長、肝肺轉移的影響

圖7 半枝蓮乙醇提取物對MHCC-97H細胞裸鼠移植瘤肺和肝轉移的影響(HE染色，×200)

表1 半枝蓮乙醇提取物對移植瘤肝、肺轉移的影響

4 討論

肝細胞癌惡性程度較高，易發生侵襲和轉移，術后較高的復發和轉移率是治療肝癌的重大障礙。中醫上無“肝癌”這一病名，肝癌的“積聚”“癥瘕”“臌脹”“脅痛”“黃疸”等臨床癥狀與中醫經典著作《內經》中的“積”病相似，因此，眾多中醫專家采用扶正祛邪、活血化瘀、疏肝理氣、解毒抑瘤等法治療肝癌[14-15]，發揮了中草藥獨特的功效和協同干預作用，在臨床廣泛應用于抑制腫瘤進展和轉移。半枝蓮是中醫學領域中常用的抗腫瘤組方藥物，已有研究報道，半枝蓮可抑制多種腫瘤如非小細胞肺癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌和胃癌的增殖和侵襲轉移[16-20]。

細胞增殖與凋亡的穩態失衡是腫瘤的發病機制之一，因此，可通過抑制細胞增殖，阻滯細胞周期的進展，促進細胞凋亡，從而減緩肝癌細胞的發展。研究顯示，半枝蓮乙醇提取物作用Hep-G2細胞72 h后，可促使早期凋亡細胞增多，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，阻滯細胞周期進展，抑制肝癌細胞生長[21]。半枝蓮主要活性成分木犀草素通過促進細胞凋亡和阻滯細胞周期G0/G1期(Huh 7細胞)或G2/M期(HepG2)，調控多個細胞周期和凋亡相關基因包括cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p21、p27、Bax和Bcl-2等的表達[13]，抑制肝癌細胞生長。細胞周期的相關蛋白，特別是CyclinD1在很多腫瘤細胞中高表達，加速了細胞周期進展，在細胞增殖中起到癌基因的作用[22-23]。Bcl-2和Bax是調控凋亡的蛋白，兩者形成二聚體而又互相拮抗，當機體受到外界異常刺激后，若Bcl-2表達高于Bax時，抑制細胞凋亡；若Bax表達高于Bcl-2時，激活Caspase-3蛋白表達，從而促進細胞凋亡[24]。半枝蓮乙醇提取物作用人肝癌SMMC-7721細胞后，使得Caspase-3蛋白表達顯著上升，Bcl-2和Survivin蛋白表達明顯下降，促進細胞凋亡[25]。本研究結果顯示，半枝蓮乙醇提取物顯著抑制MHCC-97H和MHCC-97L細胞的體外增殖和體內移植瘤生長，其機制與降低CyclinD1、Bcl-2、Ki-67蛋白表達水平，提高P27和Bax蛋白表達水平，阻滯細胞周期于G0/G1期，促進細胞凋亡等有關。

惡性腫瘤細胞的侵襲與轉移在腫瘤相關死亡中起著關鍵作用。EMT標志物E-cadherin和Vimentin是HCC進程和侵襲的決定性分子[12]。研究顯示，半枝蓮乙醇提取物通過阻斷TGF-β/Smad/AMPK信號通路，上調E-cadherin蛋白表達水平，下調N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平，逆轉TGF-β誘導的上皮間質轉化，抑制肝癌 HepG2細胞遷移及侵襲[26]。課題組前期的研究顯示，半枝蓮提取物可降低HBV陽性肝細胞癌HepG2.2.15和Hep3B細胞的劃痕愈合率，抑制細胞的遷移和侵襲[9]。此外，半枝蓮乙醇提取物也可抑制HepG2肝癌細胞侵襲和遷移，誘發細胞自噬，該作用與半枝蓮提取物抑制Raf/MEK/ERK信號通路有關[27]。本研究結果顯示，半枝蓮乙醇提取物可下調Vimentin蛋白表達水平，上調E-cadherin蛋白表達水平，降低細胞劃痕愈合率，減少遷移和侵襲細胞數目。

腫瘤干細胞具有較強的增殖和自我更新能力，與腫瘤細胞耐藥、復發、轉移和不良預后密切相關。研究顯示，腫瘤干細胞標志物EpCAM和 CD133參與肝癌惡性進程的發展，通過免疫組化檢測到這兩個指標在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織[28]，EpCAM和CD133的高表達可提示肝癌患者預后不良。本研究也顯示，半枝蓮乙醇提取物可降低干細胞EpCAM+與CD133+細胞數量及球體形成，與Liu等[29]的研究報道相同，提示半枝蓮乙醇提取物可通過調控干細胞特性相關分子，抑制肝癌MHCC-97H和MHCC-97L細胞的侵襲和轉移能力。

綜上所述，半枝蓮乙醇提取物可通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期進程、促進肝癌細胞凋亡、調控上皮間質轉化和干細胞特性相關基因表達抑制肝癌MHCC-97H和MHCC-97L細胞體內外生長和侵襲，為臨床上半枝蓮乙醇提取物治療HCC提供理論依據。