基于生物信息學探討中藥調節軟骨細胞鐵死亡干預膝骨性關節炎*

余鵬，王咪，沈錦濤，劉洪飛，程韶，李慧英

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.上海中醫藥大學，上海 201203； 3.河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002； 4.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)作為常見的慢性骨關節疾病，使無數患者深受病痛折磨。隨著對KOA研究的深入，研究人員對其復雜的發病機制也有了新認識。由于關節軟骨自我修復與損傷的動態平衡被打破，軟骨細胞合成與分解失衡，最終導致關節結構破壞，其基本病理變化為異常的軟骨細胞分化或肥大、衰老及死亡[1]。關節軟骨由致密的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)構成，僅包含一種細胞類型——軟骨細胞，因缺乏神經、血管及淋巴管的穿行，關節軟骨的自我修復與內在愈合能力有限。

鐵死亡作為鐵依賴性的新型細胞程序性死亡方式，主要包括鐵離子累積與脂質過氧化兩個生物過程[2]。鐵離子過載會加速軟骨細胞分解代謝相關因子基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)等的表達上調，降低軟骨細胞合成代謝因子聚集蛋白聚糖的表達[3]，并抑制Ⅱ型膠原蛋白的表達[4]。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)導致脂質過氧化物及其降解產物的積累，從而誘導鐵死亡，促使軟骨細胞的死亡[5]。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是軟骨分化過程中重要的調節因子，可以誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化，而鐵離子可以導致HIF-1失活，降低軟骨細胞的分化[6]。軟骨細胞的異常肥大是KOA病變的開始，基礎實驗表明過量的鐵離子可以導致軟骨細胞優先向肥大表型分化，從而加速軟骨退變[3]。因此，鐵死亡可以加速軟骨細胞的死亡，對KOA的發生發展產生了重要影響。

目前，治療早中期KOA，外用或口服非甾體類消炎藥是首選[7]，但長期服用后可能會引起胃腸道及心血管疾病等不良事件的發生。目前治療KOA的中藥在臨床中雖然暫時沒有權威的循證醫學證據支持，但根據中醫辨證論治與遣方用藥，可以快速緩解癥狀，改善病情，且不良反應小，顯示出獨特的優勢[8]。研究表明，鐵過載誘導軟骨細胞的退變，黃芪提取物刺芒柄花素可以降低軟骨細胞內鐵濃度，通過靶向Nrf2/GPX4信號通路防止脂質過氧化，調節鐵穩態，延緩KOA的進展[9]。淫羊藿苷通過激活Xc-/GPX4軸抑制鐵死亡，保護脂多糖誘導的滑膜細胞免于死亡[10]。目前關于中藥調節KOA患者軟骨細胞鐵死亡的研究較少，需要進一步探索其治療機制。本研究基于鐵死亡對軟骨細胞的重要影響，運用生物信息學與數據挖掘，探索在KOA中調節軟骨細胞鐵死亡的中藥靶點、化合物及用藥規律，為今后臨床及實驗研究KOA鐵死亡的用藥提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 差異靶點收集及富集分析從GEO數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中下載關于膝骨性關節炎的轉錄組學數據。搜索標準：①膝骨性關節炎；②人類；③軟骨細胞[11]。獲得轉錄組數據GSE114007。GSE114007數據包含18個正常軟骨組織，20個KOA軟骨組織。運用軟件fastQC對數據進行質控，Hisat2+featurecounts進行數據比對與計數，DESeq2進行數據分析，篩選軟骨細胞差異基因的標準為|log2FC|>1，p-adj<0.05，獲得軟骨細胞差異基因。從FerrDb數據庫(http：//www.zhounan.org/ferrdb/)下載鐵死亡相關靶點。通過R語言將獲取的軟骨細胞差異基因與鐵死亡相關靶點取交集，得到軟骨細胞鐵死亡表達差異基因靶點，通過蛋白質數據庫UniProt(http：//www.uniprot.org)，將得到的差異基因靶點進行映射，獲得相應的基因靶點全稱，將沒有映射到的基因靶點剔除，余下的為潛在基因靶點。運用R語言中“clusterProfiler”包進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路分析。

1.2 構建靶點-化合物網絡運用TCMSP數據庫(http：//tcmsp-e.com)檢索潛在基因靶點所對應的化合物，根據ADME參數常用指標：口服利用度(OB)≥30%，類藥性(OL)≥0.18和Lipinski三規則[12]：相對分子質量(MW)<500、脂水分配系數(AlogP)<5、氫鍵給體數目(Hdon)<5，篩選出候選化合物。利用cytoscape 3.9.1軟件構建潛在靶點-候選化合物網絡，對該網絡節點進行拓撲分析，得出干預軟骨細胞鐵死亡的關鍵靶點。

1.3 構建靶點-化合物-中藥網絡根據候選化合物，通過TCMSP數據庫，檢索相應的中藥，運用cytoscape 3.9.1軟件構建潛在靶點-候選化合物-中藥網絡，通過網絡拓撲學分析得出調節軟骨細胞鐵死亡的主要中藥及中藥調節軟骨細胞鐵死亡核心化合物。

1.4 統計中藥性味歸經和用藥規律將收集到的中藥，與《中華人民共和國藥典》《中國臨床藥物大辭典》《中藥學》進行匹配，獲取每味中藥的性味歸經及治療作用，利用Excl統計納入中藥的性味歸經及藥物作用類別。

1.5 分子對接驗證通過PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取1.3項下得到的核心化合物的3D分子結構作為配體。將1.2項下獲取的關鍵靶點通過RCSB PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)篩選后得到與之相對應的PDB ID號，作為蛋白受體，利用PyMOL軟件與 ADFR 軟件對蛋白受體進行去水、加氫預處理。將預處理后的蛋白受體與化合物配體利用SailVina final軟件轉化為pdbqt格式文件，通過AutoDock Vina進行分子對接。在PyMOL軟件中將分子對接的文件進行可視化展示，利用R包pheatmap對分子對接的結果進行可視化處理，并進行數據分析驗證。

2 結果

2.1 軟骨細胞與鐵死亡差異靶點通過軟件DESeq2分析得到軟骨細胞差異靶點4 004個，從FerrDb數據庫獲取鐵死亡相關靶點487個，取二者交集之后得到63個靶點，通過UniProt數據庫匹配后，刪除未匹配到的3個靶點，最終獲得60個軟骨細胞鐵死亡差異靶點。運用R包對差異靶點進行GO富集分析，結果顯示生物過程(biological Process，BP)有783條目，主要涉及細胞對營養水平、外界刺激、化學應激及氧化應激的反應；細胞組分(cellularComponent，CC)有51條目，主要涉及分子細胞膜(過氧化物酶體膜、細胞基膜等)及因子復合物(轉錄調節復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等)；細胞功能有96條目，主要涉及鐵離子結合、轉錄因子活性與結合等，詳見圖1A。對差異靶點進行KEGG信號通路分析，結果顯示共有45個信號通路，主要涉及鐵死亡、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、IL-17信號通路等，詳見圖1B。

注：A：GO分析；B：KEGG分析圖1 軟骨細胞鐵死亡差異靶點分析

2.2 潛在靶點-候選化合物網絡將60個差異靶點通過TCMSP數據庫進行匹配，有16個差異靶點可以匹配到相應化合物，根據ADME參數和Lipinski三規則，最終符合納入標準的有993個化合物，將其作為候選化合物，對應9個軟骨細胞鐵死亡相關靶點，將其作為潛在靶點，潛在靶點信息詳見表1。構建潛在靶點-候選化合物網絡，通過網絡拓撲學分析發現，關聯靶點最多的化合物為漢黃芩素、漆黃素、川陳皮素、尼泊爾鳶尾異黃酮、異鼠李素，分別對應的靶點為5、5、4、4、4，關聯化合物的潛在核心靶點為PTGS2、DPP4、PPARG、CDKN1A、RELA、NQO1。選取度值>1的潛在靶點及其候選化合物構建潛在靶點-候選化合物網絡，詳見圖2。

2.3 潛在靶點-候選化合物-中藥網絡在TCMSP數據庫中，根據候選化合物匹配篩選中藥，統計中藥386味，將中藥與潛在靶點和候選化合物構建網絡，進行網絡拓撲學分析。分析結果顯示關聯化合物度值排名前7位的中藥為甘草、丹參、延胡索、降香、鉤藤、黃芩、苦地丁，度值依次為80、48、46、27、26、25、21，詳見圖3A。關聯中藥的化合物，根據度值中位數及經驗判斷，選取候選化合物度值>10的為核心候選化合物，總共有17個化合物，前5位化合物分別為山柰酚、木樨草素、異鼠李素、刺槐素、芒柄花黃素，詳見表2。通過候選化合物的橋接作用，統計得到作用于5個靶點的中藥有骨碎補、半枝蓮、枳實、麻黃、女貞子，詳見圖3B，因此推測這5味中藥可能對軟骨細胞鐵死亡干預效果較好，可嘗試將其作為研究治療KOA的作用藥物。以中藥及候選化合物度值>4為標準，構建潛在靶點-候選化合物-中藥網絡，詳見圖4。

表1 軟骨細胞鐵死亡潛在靶點

圖2 潛在靶點-候選化合物網絡圖

圖3 調節軟骨細胞鐵死亡的中藥

表2 中藥調節軟骨細胞鐵死亡核心化合物(度值>10)

圖4 潛在靶點-候選化合物-中藥網絡圖

2.4 中藥性味歸經及用藥規律將2.3項下統計到的386味中藥，根據《中華人民共和國藥典》《中藥學》及《中國臨床藥物大辭典》進行性味歸經及治療作用統計，剔除未收錄的中藥38味，最終統計348味中藥。結果表明納入的中藥性味以寒溫并重，苦、辛、甘味藥為主，歸肝、肺、脾胃經的中藥為主，詳見表3。以清熱類中藥最多(70味)，其次是補虛類和活血化瘀類中藥，詳見圖5。

表3 中藥性味歸經頻數統計表 (次)

圖5 調節軟骨細胞鐵死亡的中藥作用類別頻數分布

2.5 分子對接驗證結果6個潛在關鍵靶點經RCSB PDB數據庫篩選后，CDKN1A未匹配到相應的PDB ID號，將其刪除，其余5個關鍵靶點的PDB ID號分別為PTGS2(PDB ID：5IKQ)，DPP4(PDB ID：5T4B)，PPARG(PDB ID：3V9V)，RELA(PDB ID：6NV2)，NQO1(PDB ID：1KBQ)，隨后將5個關鍵靶點與17個核心化合物進行分子對接。分子對接的Affinity值<-4.25 kcal·mol-1表示配體與受體之間有結合活性，Affinity值<-5.00 kcal·mol-1表示二者之間的結合活性較佳，Affinity值<-7.00 kcal·mol-1表示二者之間有很強的結合活性[13]。對接結果顯示，最小值為-9.22 kcal·mol-1，最大值為-5.96 kcal·mol-1，所有對接的Affinity值均<-5.00 kcal·mol-1，說明關鍵靶點與核心化合物之間均有較好的結合活性，也從一定程度上證明篩選干預軟骨細胞鐵死亡的中藥作用靶點與化合物的可靠性。其中靶點DPP4、PPARG與所有核心化合物的結合能均<-7 kcal·mol-1，表明這些化合物與關鍵靶點有更佳的結合能力，可能在中藥干預軟骨細胞鐵死亡中有著關鍵作用，詳見圖6。根據Affinity值、潛在關鍵靶點與核心化合物，選取5對受體與配體分子對接后的結果進行可視化展示，分別為PTGS2-liteolin(木樨草素)、DPP4-isorham-netin(異鼠李素)、PPARG-kaempferol(山柰酚)、RELA-formononetin(芒柄花黃素)、NQO1-acacetin(刺槐素)，詳見圖7。

圖6 關鍵靶點與核心化合物分子對接的結果熱圖

注：A：PTGS2-liteolin(木樨草素)；B：DPP4-isorhamnetin(異鼠李素)；C：PPARG-kaempferol(山柰酚)；D：RELA-formononetin(芒柄花黃素)；E：NQO1-acacetin(刺槐素)圖7 關鍵靶點與核心化合物分子對接示意圖

3 討論

研究表明鐵死亡屬于免疫性細胞死亡，其許多產物被證明是炎癥介質[14]。KOA的病理過程是一個慢性炎癥反應的過程，鐵死亡對于KOA的發病與治療均有較大影響，可以作為治療與預防KOA新的研究方向。中藥在干預鐵死亡方面擁有巨大的潛力，當前，關于中藥干預軟骨細胞鐵死亡的研究較少。本研究以鐵死亡相關靶點為切入點，構建靶點、化合物及中藥網絡，探索三者之間的關聯，探尋調節軟骨細胞鐵死亡的中藥及用藥規律。

通過GO功能富集分析及KEGG信號通路分析發現，60個軟骨細胞鐵死亡差異靶點主要集中在鐵死亡信號通路、HIF-1信號通路及白細胞介素-1β信號通路中，這與鐵死亡干預KOA的發病過程是相吻合的，也證明了差異靶點的可靠性。HIF-1α是人體生長發育過程中關節軟骨形成的核心，可以促進軟骨祖母細胞的分化，并能抑制軟骨細胞的異常肥大，鐵離子可以降低HIF-1α活性，抑制HIF-1信號通路，從而加速軟骨退變[6]。在 IL-1β誘導的炎癥環境中，軟骨細胞會發生鐵死亡相關蛋白表達的變化，促進MMP13表達，抑制Ⅱ型膠原蛋白表達，從而加速KOA的進展[5]。

構建網絡后關聯化合物的潛在核心靶點為PTGS2、DPP4、PPARG、CDKN1A、RELA、NQO1。其中PTGS2又稱為環氧化酶-2，可以編碼其產物前列腺素E2，加速KOA進程[15]，同時高表達的PTGS2也是細胞發生鐵死亡過程中脂質過氧化的生物標記物[16]。研究表明，DPP4介導細胞的脂質過氧化，誘導腫瘤壞死因子的產生，導致鐵死亡的發生，加速軟骨細胞的衰老與死亡[17-18]。PPARG有較強的細胞抗氧化功能，提高PPARG表達水平，可以增強細胞的抗鐵死亡能力，積極參與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的調控，降低炎癥介質水平[19-20]。CDKN1A誘導成纖維細胞生長因子2的表達，抑制軟骨細胞的增殖與表達，p53介導 CDKN1A 的表達，可以抑制鐵死亡的出現[18，21]。RELA是核轉錄因子-κB信號通路中的關鍵分子，廣泛參與炎癥與免疫反應，該通路激活后，導致炎癥反應增加，產生大量炎癥因子，誘導鐵死亡的發生。細胞內活性氧的增加，會誘導脂質過氧化的出現，從而提高NQO1的水平，可以增強細胞抗氧化能力，激活抗氧化信號通路，抑制鐵死亡[22-23]。

篩選得到的中藥關聯的核心化合物中，根據動物實驗研究表明，山柰酚、木樨草素、異鼠李素、刺槐素、芒柄花黃素等化合物均可以降低相關炎癥因子的表達，抑制軟骨細胞的炎癥損傷，延緩KOA的發展[24-28]。其中山柰酚可以激活核因子紅細胞系2相關因子2/谷胱甘肽過氧化物酶4信號通路，增強了細胞的抗氧化能力，抑制細胞脂質過氧化的積累，延緩鐵死亡的發生[29]。木樨草素因其較強的抗氧化及抗炎能力，可以抑制脂質過氧化與鐵離子的累積，已成為靶向治療鐵死亡的新興天然化合物[30]。根據網絡拓撲學分析可知，關聯靶點最多的中藥為骨碎補、半枝蓮、枳實、麻黃、女貞子等，提示這幾味中藥可能是干預軟骨細胞鐵死亡關鍵中藥，可以為研究中藥治療KOA的作用機制及用藥思路提供一定方向。其中骨碎補的質量標志物柚皮苷可以防止軟骨基質的降解，抑制 NF-κB 信號通路的激活，降低炎癥反應，保護軟骨細胞[31]，同時柚皮苷調節鐵死亡參與的Nrf2/GPX4信號通路，下調活性氧水平，抑制鐵死亡[32]。半枝蓮的主要化合物燈盞花乙素通過調節核轉錄因子-κB及Nrf2信號通路，逆轉KOA中聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白的低表達，降低軟骨細胞中的炎癥表達[33]。分子對接結果表明，所篩選的關節靶點與核心化合物是合理與可靠的，推測在中藥干預軟骨細胞鐵死亡中發揮了關鍵作用。

干預軟骨細胞鐵死亡的中藥藥性為寒溫并重，臨床中膝骨性關節炎的證候是復雜多變的，單純寒證或單純熱證并不多見，多數為寒熱錯雜的病證，用藥也需要寒性藥與溫性藥并用。中藥藥味以苦、辛、甘為主，苦味能泄，能燥，即清熱瀉火燥濕；辛味能行，即行氣行血，活血化瘀；甘味能補，能緩，即補虛扶正，緩急止痛。這與膝骨性關節炎中醫證候類型的用藥是相吻合的。篩選的中藥主要歸肝、肺及脾胃經，肝主筋，筋附于骨而聚于關節，且肝藏血，是鐵離子主要儲存場所，肝主疏泄，肺主治節，肝升肺降，一升一降，升降協調，共同調節人體氣機及氣血運行，對人體的生理功能有著重要的調節作用。脾胃為后天之本，脾主運化，胃主受納，外源性鐵元素的攝入主要通過食物，納運協調，可以促進鐵離子的正常吸收與代謝。根據用藥規律分析，干預軟骨細胞鐵死亡的中藥主要為清熱類、補虛類及活血化瘀類，這與所篩選出的中藥藥性相匹配，治療細胞鐵死亡時需要清熱消炎，行氣活血，補虛扶正。

本研究基于網絡信息學與數據挖掘，以軟骨細胞與鐵死亡為切入點，探究鐵死亡在KOA中的作用機制，分析中藥干預軟骨細胞鐵死亡關鍵靶點、核心化合物及用藥規律，為研究中醫藥治療KOA的作用機制提供新的思路與方法。本研究進行了中藥的定性分析，可為后續進行藥物定量驗證研究提供依據。